張曉麗，吳望君，袁 璐，陳 凱

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州 311199）

纖維素酶是一種多組分的復(fù)合酶，能將纖維素、半纖維素降解成有利于動物胃腸道消化吸收的小分子物質(zhì)，從而提高飼料營養(yǎng)價值及轉(zhuǎn)化率。目前，飼料中纖維素酶的測定方法主要有還原糖法（Ghose，1987）、CMC 黏度法（Jecfa，2000）。NY/T 912-2004《飼料添加劑纖維素酶活力的測定分光光度法》是利用纖維素酶水解羧甲基纖維素，生成具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖，這些還原性糖與DNS試劑在水浴條件下發(fā)生顯色反應(yīng)，反應(yīng)液顏色的強度與酶解產(chǎn)生的還原糖的濃度成正比，因此可以通過分光光度法測定還原糖的生成量來計算纖維素酶活力（僬仕彥等，2004）。該方法操作簡單，且結(jié)果重復(fù)性好，被廣泛使用。但在使用過程中發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)準(zhǔn)的測定方法及計算公式對于樣品本底中的葡萄糖無法準(zhǔn)確扣除。因此，本研究對計算公式進行重新編輯，對方法進行了一定的改進，以期為還原糖法測定飼料中的纖維素酶活力提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑 0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液 （pH 5.5）；DNS試劑：稱取 3，5二硝基水楊酸 3.15 g，加水500 mL后水浴至45℃，加氫氧化鈉（200 g/L）100 mL、四水酒石酸鉀鈉 91.00 g、苯酚 2.50 g、無水亞硫酸鈉2.50 g，溶解后定容至1000 mL，儲存在棕色瓶中，避光保存；0.8%（m/V）羧甲基纖維素鈉水溶液 （CMC-Na，Sigma 公司生產(chǎn)）；10.0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；待測酶液：稱取酶樣適量于250 mL錐形瓶，準(zhǔn)確加入100 mL緩沖溶液振搖 30 min，放置1 h后搖勻，取部分溶液離心，上清液二次稀釋至合適濃度（0.04～0.06 U/mL），供測定使用。

1.2 儀器 TU 1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 試樣空白的制備 吸取2.00 mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液（已37℃平衡10 min），加入到刻度試管中，再加入5.00 mL DNS試劑，電磁振蕩3 s。然后加入2.00 mL羧甲基纖維素鈉溶液（已37℃平衡 10 min），37 ℃保溫 30 min，加入 0.3 mg/mL 葡萄糖溶液1.00 mL，混勻，沸水浴加熱5 min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至25 mL，渦旋3 s，作為試樣空白。

1.4 樣品的制備 吸取2.00 mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液（已37℃平衡10 min），加入到刻度試管中，再加入2.00 mL羧甲基纖維素鈉（已37℃平衡 10 min），渦旋 3 s，37 ℃精確保溫 30 min。加入5.00 mL DNS試劑，電磁振蕩3 s，以終止酶解反應(yīng)，加0.3 mg/mL葡萄糖溶液1.00 mL，混勻，沸水浴加熱5 min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25 mL，電磁振蕩3 s。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對照，在540 nm處測定吸光度。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 計算公式的討論

原農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)酶活力計算公式為：

原農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的公式等同于以試樣空白調(diào)零測試樣溶液，僅適用于試樣本底葡萄糖濃度為零的情況，而樣品本底中葡萄糖濃度是否為零無法通過吸光度判斷。建議修改為：

式中：X為試樣的纖維素酶活力，U/g；CE為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上回歸的酶反應(yīng)液的葡萄糖濃度，mg/mL；CB為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上回歸的酶空白樣的葡萄糖濃度，mg/mL；V為樣品總稀釋倍數(shù)；M為葡萄糖的摩爾質(zhì)量[M（C6H12O6）=180.2 g/mol]；t為酶解反應(yīng)時間，min；m 為稱樣量，g。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限 吸取乙酸-乙酸鈉緩沖液5.0 mL，加入DNS試劑5.0 mL，沸水加熱5 min，用自來水冷卻至室溫，用水定容至25 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)空白溶液。

分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 100、200、300、400、500、600、700 μL， 分別用乙酸-乙酸鈉緩沖溶液定容至10 mL。

分別吸取上述濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液各2.00 mL，置刻度試管中，各加入3.00 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液和5.00 mL DNS試劑，振搖3 s。沸水浴加熱5 min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25 mL，搖勻。以標(biāo)準(zhǔn)空白溶液調(diào)零，在540 nm處測定吸光度A，以葡萄糖濃度為Y軸、吸光度A值為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（不同批次的DNS配置的標(biāo)準(zhǔn)曲線略有差異），見圖1。稱樣量為 10 g，酶稀釋液濃度為 0.04 U/g，按 1.1步驟處理，定量限為0.8 U/g。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品空白實驗回歸準(zhǔn)確性的研究 由圖1可知，當(dāng)A=0時，回歸曲線的葡萄糖濃度為0.108 mg/mL，不能準(zhǔn)確反映樣品本底中葡萄糖的準(zhǔn)確濃度。為此，嘗試了三種方法。

圖1 纖維素酶活力測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.1 DNS中添加葡萄糖對測定結(jié)果的考察JECFA（2000）標(biāo)準(zhǔn)方法中，在DNS溶液中添加了30μg/mL乳糖，從而使標(biāo)準(zhǔn)曲線盡可能通過原點。以此為參考，在DNS溶液中添加不同濃度的葡萄糖制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，對不同濃度的葡萄糖溶液進行回歸測定。由表1可知，當(dāng)溶液中葡萄糖濃度≤80μg/mL，DNS中添加不同濃度的葡萄糖，結(jié)果都不能準(zhǔn)確測定溶液中葡萄糖濃度，因此不考慮在DNS中添加葡萄糖的方法。

表1 DNS溶液中添加不同濃度的葡萄糖考察結(jié)果mg/mL

2.3.2 DNS溶液加入量對測定結(jié)果的考察 國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法中，DNS溶液的反應(yīng)量從3/25～4/6（DNS加入量/最終定容體積）。按照表2配制酶反應(yīng)體系，用標(biāo)準(zhǔn)曲線對不同含量的葡萄糖溶液進行回歸測定。結(jié)果顯示（見表3），加入不同量的DNS，100μg/mL濃度以下的葡萄糖仍不能準(zhǔn)確回歸，因此不考慮改變DNS的添加量。

表2 酶反應(yīng)液各溶液配比

表3 葡萄糖含量測定結(jié)果mg/mL

2.3.3 試樣空白溶液和試樣溶液中添加葡萄糖對測定結(jié)果的考察 為提高試樣空白溶液測定響應(yīng)值，在試樣溶液及試樣空白溶液37℃保溫30 min且與DNS反應(yīng)后，在反應(yīng)液中分別添加不同濃度的葡萄糖1 mL，按農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法操作，進行上機測定，結(jié)果見表4。由表4可以看出，試樣溶液及試樣空白溶液與DNS反應(yīng)結(jié)束后，添加1 mL濃度為0.2～0.6 mg/mL的葡萄糖時，測得的試樣溶液及試樣空白溶液中的葡萄糖上機濃度較穩(wěn)定，所測的酶活力RSD為1.9%?？紤]到添加0.2 mg/mL葡萄糖時，樣品空白吸光度約為0.010，響應(yīng)值低 （對于新配置DNS，吸光度響應(yīng)會更低），當(dāng)添加濃度過大時，極易造成試樣溶液的總濃度超出曲線范圍，因此試樣溶液及試樣空白溶液中葡萄糖的添加濃度確定為0.3 mg/mL，添加量為1 mL。當(dāng)測得的試樣空白溶液中葡萄糖濃度大于0.35 mg/mL且試樣反應(yīng)液中葡萄糖濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍時，可用1 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液代替0.3 mg/mL葡萄糖溶液。

2.4 酶液浸提時間對酶活力的影響 對三個不同的樣品進行提取，4℃浸提不同時間的試樣進行雙份稀釋，稀釋液搖勻后測定，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，不浸提時，酶液不能充分溶出，樣品相對偏差較大；當(dāng)浸提時間為1～24 h，酶活力變化差異為2.0%～3.4%，考慮到時間成本，建議浸提時間為1 h。

表4 試樣空白溶液和試樣溶液中添加葡萄糖的考察結(jié)果

圖2 4℃浸提不同時間的酶活力

2.5 參加酶反應(yīng)時試樣溶液濃度的考察 由表5可以看出，參加酶反應(yīng)時試樣的酶活力對樣品活力的測定影響較大，當(dāng)待測酶液活力為0.043～0.08 U/mL時，僅稀釋倍數(shù)造成的測定相對偏差就達(dá)到了10.0%，超過了標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的8%，建議縮小待測酶液的活力范圍為0.04～0.06 U/mL。

表5 待測酶液酶活力對測定結(jié)果的影響（n=3）

2.6 與農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)比較 分別采用文章中的方法、公式與農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對不同樣品 （樣品5由樣品2稀釋酶液中添加0.15 mg/mL葡萄糖，不考慮葡萄糖對酶解反應(yīng)的影響，二者酶活力一致）進行測定比較，結(jié)果見表6和表7。采用本方法測定時，樣品測定重復(fù)性好，RSD為3.6%～5.0%，且對樣品2和樣品5的測定可得到相近的數(shù)值，二者的相對偏差為1.7%，而采用NY/T 912-2004方法測定時，樣品2與樣品5相差較遠(yuǎn)，相對偏差為12.1%，由此發(fā)現(xiàn)新建的方法能夠較準(zhǔn)確的測定樣品空白的葡萄糖濃度，從而更準(zhǔn)確的反映酶活力。

表6 本文建立的方法測定的纖維素酶活力

表7 按NY/T 912-2004方法測定的纖維素酶活力

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，樣品4℃浸提1 h即可充分提??；稀釋酶液濃度為0.04～0.06 U/mL時可較好的控制樣品測定的穩(wěn)定性；通過試樣溶液及試樣空白溶液37℃酶解反應(yīng)結(jié)束后添加1 mL 0.3 mg/mL的葡萄糖溶液，可提高試樣溶液及試樣空白溶液的葡萄糖濃度，從而解決了試樣空白溶液中葡萄糖濃度測定不準(zhǔn)的問題，同時對計算公式進行重新編輯，使得酶活力測定更加精準(zhǔn)。

對于試樣稀釋液中葡萄糖濃度已經(jīng)較高的樣品，即試樣空白中葡萄糖濃度大于0.5 mg/mL的樣品，其試樣反應(yīng)液中葡萄糖濃度會超過0.7 mg/mL，超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，導(dǎo)致測定不準(zhǔn)，可參考楊海峰（2014）等的方法，先用滲透膜法降低試樣中葡萄糖濃度再進行測定，或采用羅長才（2011）等研究的瓊脂糖擴散法進行測定，也可采用黏度法進行測定。