李香蘭，韓 亮，李 淼，黃哲浩*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.皮膚科；2.病理科；3.神經(jīng)外科,吉林 長(zhǎng)春130033)

間變性星形細(xì)胞瘤(AA)是星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的一種，其發(fā)病機(jī)制廣泛涉及營(yíng)養(yǎng)代謝、表觀遺傳等諸多方面[1-3]。基于系統(tǒng)生物學(xué)與生物信息學(xué)手段研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)理已經(jīng)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步[4]。其中代謝組學(xué)作為關(guān)注于機(jī)體內(nèi)小于1 kDa小分子代謝物新型組學(xué)手段已經(jīng)被認(rèn)為是揭示疾病發(fā)病機(jī)理的最佳手段之一[5]。然而，對(duì)于AA的代謝組學(xué)機(jī)制研究目前大多停留在體外細(xì)胞模型，對(duì)于機(jī)體系統(tǒng)水平的組學(xué)差異機(jī)制仍鮮有報(bào)道[6]。本研究采用基于超高效液相色譜四極桿高分辨時(shí)間飛行質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF-MS)聯(lián)用的代謝組學(xué)技術(shù)探討AA的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料甲醇、甲酸及乙腈(質(zhì)譜級(jí)，F(xiàn)isher Chemical公司，貨號(hào)：A4521/PI85170/A998-4)；亮氨酸-腦啡肽(Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)：87-89-8)；雙蒸水(廣州屈臣氏公司，貨號(hào)：20170126C)；分離膠促凝管。實(shí)驗(yàn)用分子生物學(xué)耗材及超高效液相進(jìn)樣瓶均為無(wú)菌新開(kāi)的一次性耗材。

1.2 樣本來(lái)源及患者招募患者招募自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，均為初次診斷為AA且未受任何放化療、年齡50-60歲之間。年齡與性別匹配無(wú)神經(jīng)病史健康志愿者(HC)亦被招募。所有納入研究的受試者均被明確且充分告知研究?jī)?nèi)容且簽署知情同意書(shū)。所有受試者均禁食12小時(shí)后于清晨空腹采集外周血10 ml，于分離膠促凝管中分離獲得血清，立即置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.3 樣本處理方法所采集的血清樣本于冰上避光解凍后按1：3(v/v)的比例加入甲醇，并渦旋混勻3 min使蛋白變性并于4℃，×10,000g離心去除。收集上清置于-60℃、10pa氣壓的真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h。殘留物于100 μl甲醇-水(4∶1，v/v)復(fù)溶。每個(gè)樣本汲取20 μl上清混合制備QC樣本；燈檢后上機(jī)檢測(cè)。

1.4 液相質(zhì)譜條件采用UPLC系統(tǒng)(Waters，ACQUITY；BEH C18柱，2.1 mm× 100 mm,1.7 mm)與Q/TOF質(zhì)譜儀(Waters，Xevo G2-S)。色譜條件與參數(shù)如文獻(xiàn)所述[7]并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。BEH柱溫30℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度15℃。流動(dòng)相A(0.1%甲酸水溶液)和B(0.1%的甲酸乙腈溶液)，依次進(jìn)行90%-10%梯度洗脫，流速0.4mL/min；質(zhì)譜采集模式為ESI+。

1.5 化合物鑒定組學(xué)數(shù)據(jù)的采集、峰對(duì)齊及解卷積均由Masslynx軟件平臺(tái)完成。差異性代謝物通過(guò)比對(duì)HMDB(v4.0)中物質(zhì)的精準(zhǔn)分子量及二級(jí)質(zhì)譜碎片模式(MS/MS)得以確認(rèn)同時(shí)參照Metlin高分辨二級(jí)質(zhì)譜碎片數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步確證。分子量偏差允許范圍為10 ppm。

1.6 多元協(xié)變量統(tǒng)計(jì)及生物信息學(xué)分析多元協(xié)變量分析采用SIMCA(v14.0)軟件以建立主成分分析(PCA)和基于正交的偏最小二乘法判別(OPLS-DA)模型，并進(jìn)行置換驗(yàn)證，選取投影變量重要性值(VIP)大于1且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物進(jìn)行基于MetaboAnalyst 4.0平臺(tái)的擾動(dòng)代謝通路識(shí)別[8]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)的方差齊性及正態(tài)性分別通過(guò)F檢驗(yàn)及Kolmogorov- Smirnov檢驗(yàn)完成。數(shù)據(jù)不滿(mǎn)足正態(tài)性的，使用Mann-Whitney-Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行分析。Student’st檢與Welch’st檢驗(yàn)分別用于方差齊與不齊的數(shù)據(jù)。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性P<0.05 時(shí)接受。ROC及統(tǒng)計(jì)分析由R語(yǔ)言的基礎(chǔ)統(tǒng)計(jì)包及pROC包完成。

2 結(jié)果

2.1 主成分分析本研究共納入符合條件的AA患者12名(男/女：6/6)，HC受試者15名(男/女：8/7)。所有樣本的PCA分析結(jié)果如圖1A所示。PCA模型共解析得到5個(gè)主成分，累計(jì)為68.24%。QC樣本緊密聚集在PCA圖中央，表明色譜及質(zhì)譜穩(wěn)定性良好。PCA分析結(jié)果顯示，AA患者的系統(tǒng)代謝模式與HC存在顯著的差別，且兩組樣本中并無(wú)顯著異常樣本存在(置信區(qū)間95%內(nèi))。

(A) PCA分析結(jié)果；(B) OPLS-DA模型分析結(jié)果；(C) OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)結(jié)果；(D) 差異性化合物S-plot展示圖。

2.2 基于正交的偏最小二乘法判別分析OPLS-DA模型被進(jìn)一步建立，用于判別兩組之間的顯著性差異。如圖1B所示，兩組樣本被顯著區(qū)分，表明兩組之間差異顯著。進(jìn)一步的模型置換檢驗(yàn)結(jié)果如圖1C所示，Q2<0.5且擬合線顯著位于隨機(jī)線下方，表明OPLS-DA模型成功，且CV-ANOVA檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P<0.0001，表明基于此判別模型識(shí)別的差異性化合物可信度高，可代表兩組之間的顯著差異組分。

2.3 差異代謝物OPLS-DA模型共涉及4386個(gè)潛在化合物特征，而基于該判別模型識(shí)別的VIP >1且組間P<0.05的差異性化合物經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后共識(shí)別15種差異性物質(zhì)，如表1及圖1D中S-plot所示。其中，ROC分析表明，二氫鞘氨醇及乳糖神經(jīng)酰胺作為生物標(biāo)志物具有極好的敏感性及準(zhǔn)確性(AUC>98%)。

表1 差異性代謝產(chǎn)物識(shí)別與鑒定

2.4 擾動(dòng)的代謝通路上述已經(jīng)識(shí)別的差異性化合物參與了4條顯著擾動(dòng)的代謝通路(-log(P) >4且Impact > 0.1)，包括鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、亞油酸代謝以及咖啡因代謝。如圖2所示，各代謝通路擾動(dòng)程度存在差異。此外，視黃醇代謝通路雖有一定程度擾動(dòng)，但未達(dá)到顯著性水平(-log(P) <2且Impact < 0.1)。各代謝通路中的差異代謝物如表1所示。

Pathway Impact,代謝通路擾動(dòng)程度值

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤是膠質(zhì)瘤中術(shù)后易復(fù)發(fā)的一類(lèi)顱內(nèi)腫瘤。星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，AA患者的預(yù)后較差，兩年生存率往往低于30%[9]。已有研究報(bào)道，AA的發(fā)病機(jī)制涉及環(huán)境因素、表觀遺傳以及免疫調(diào)控等諸多方面[10-12]。近年來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)因其所關(guān)注對(duì)象的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)生機(jī)制的研究[5,7]。目前，代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的研究大多局限于體外細(xì)胞水平或僅關(guān)注了惡性母細(xì)胞瘤的代謝模式差異[13]，而對(duì)于AA的系統(tǒng)差異代謝模式尚無(wú)明確報(bào)道。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AA患者存在顯著改變的代謝模式，其原因可能與機(jī)體中惡性細(xì)胞自身能量代謝模式等的顯著改變相關(guān)[14]。具體而言，我們?cè)谕庵苎泄舶l(fā)現(xiàn)了15種差異代謝產(chǎn)物并預(yù)測(cè)了4條顯著擾動(dòng)的代謝通路。關(guān)于AA的代謝擾動(dòng)通路，甘油磷脂及鞘脂類(lèi)成分作為中樞神經(jīng)元的關(guān)鍵組成成分已有報(bào)道[15]，本研究以前報(bào)道了代謝擾動(dòng)通路對(duì)于腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步增殖、生長(zhǎng)、抗凋亡及機(jī)體的免疫調(diào)控具有至關(guān)重要的作用[16]。

諸多研究表明，甘油磷脂、鞘脂類(lèi)組分及亞油酸類(lèi)物質(zhì)能直接參與機(jī)體能量代謝、免疫及炎癥狀態(tài)的調(diào)節(jié)[5]，顯示這三類(lèi)物質(zhì)與AA的發(fā)病機(jī)制有著密切的關(guān)聯(lián)。Albers M 等利用基于質(zhì)子去耦合的核磁共振技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)原始神經(jīng)外胚層腫瘤組織的甘油磷脂代謝顯著紊亂[17]，但機(jī)制至今尚不明確。線粒體功能異常已成為公認(rèn)的癌癥發(fā)生的標(biāo)志，Kiebish M等研究已發(fā)現(xiàn)腦線粒體中磷脂酰膽堿及磷脂酰乙醇胺代謝異常的小鼠極易形成自發(fā)性膠質(zhì)瘤[18]。

近來(lái)，鞘脂代謝物參與膠質(zhì)瘤免疫學(xué)機(jī)制的研究已經(jīng)逐步開(kāi)展，如二氫神經(jīng)酰胺參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬[19]、神經(jīng)酰胺促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[20]而半乳糖神經(jīng)酰胺則能參與到樹(shù)突狀細(xì)胞及NK細(xì)胞自然殺傷腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中[21]。本研究系統(tǒng)地觀察了甘油磷脂代謝及鞘脂代謝通路在AA中的全身擾動(dòng)情況，并且挖掘出了兩個(gè)關(guān)鍵鞘脂代謝化合物——二氫鞘氨醇及乳糖神經(jīng)酰胺。本研究結(jié)果提示：這兩個(gè)關(guān)鍵鞘脂代謝化合物均可能是潛在的AA診斷標(biāo)志物。我們還推測(cè)：這兩化合物也存在與AA腫瘤的相關(guān)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫調(diào)控直接相關(guān)的可能。

亞油酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)于AA腫瘤細(xì)胞具有直接的干預(yù)作用已被報(bào)道[22]，本研究的結(jié)果與其相符。除此之外，咖啡因代謝及相關(guān)代謝物，如組織蛋白酶B、MAPK及Caspase-3等，已被證實(shí)參與激活膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控[23-25]，同時(shí)對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活力、細(xì)胞周期及增殖狀態(tài)有著負(fù)向調(diào)控作用[26]。本研究還發(fā)現(xiàn)：AA患者中的差異咖啡因代謝產(chǎn)物可可堿及尿可可豆素與AA發(fā)病機(jī)制存在一定程度的關(guān)聯(lián)。關(guān)于可可堿及尿可可豆素與AA的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的分子機(jī)制的研究，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

綜上，本研究鑒定的間變性星形細(xì)胞瘤患者機(jī)體顯著擾動(dòng)的差異代謝模式為深化對(duì)該疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供了新的理論基礎(chǔ)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)二氫鞘氨醇及乳糖神經(jīng)酰胺可能是潛在的AA臨床診斷的新的生物標(biāo)志物。