韓 英，趙恒山，田宇敏，3，王曉勇，劉 帥，蔚慧欣，賈麗艷，，3

（1.山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術中心，山西汾陽 032205；2.山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷 030801；3.山西白酒生物工程研究生創(chuàng)新中心，山西太谷 030801）

霉菌是白酒發(fā)酵過程中重要的一類微生物[1]。霉菌產生的糖化酶、液化酶、酯化酶，可以使淀粉分解，促進酯類物質形成[2-3]；霉菌在代謝過程中也會產生代謝產物，賦予白酒一定的風味[4-5]。目前，關于霉菌在白酒發(fā)酵中的應用主要集中于霉菌的產酶能力和霉菌對大曲及大曲風味物質形成的影響方面的研究和應用[6-7]，關于霉菌對白酒風味物質形成及風格影響的研究及應用較少。筆者認為，白酒發(fā)酵過程中，霉菌產生酶類物質的性能不容忽視，霉菌對白酒風格的影響也同樣重要。為此，課題組以風味和產酶性能，從傳統(tǒng)清香型白酒的酒醅中分離霉菌，研究不同霉菌對清香型白酒的發(fā)酵和風格的影響并研究霉菌的制曲工藝，以期為清香型及其他白酒的可調控、機械化、智能化的發(fā)展提供菌種資源及理論和應用基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

菌株：M0為黑曲霉AS3.4309，購買于中國普通微生物菌種保藏中心。

樣品：某清香型白酒廠的新鮮酒醅。

原料：新鮮、干燥、無蟲、無污染、無霉變或潮濕酸敗的麩皮。

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）[8]：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL、pH 值為自然，121 ℃下滅菌20 min后使用。

產孢子培養(yǎng)基[8]：麩皮∶水=1∶1，121 ℃下滅菌20 min。

儀器設備：FA1004B 型電子天平，上海越平科學儀器有限公司；雙列六孔型儀表恒溫水浴鍋，上海樹立儀器儀表有限公司；DH-600 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司；DL-1 型電子萬用爐，天津市大港區(qū)紅杉試驗設備廠；SGD-Ⅳ 型全自動還原糖測定儀；YXQ-50S11 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；PB-10 型pH 儀；HZ85-Z 型磁力攪拌機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 霉菌的分離、培養(yǎng)

采用孟加拉紅選擇培養(yǎng)基分離菌株。對分離菌株進行麩皮培養(yǎng)：取麩皮15 g 置于250 mL 的三角瓶中，再加15 mL 水，用棉塞和報紙包好，以121 ℃滅菌20 min，待高壓蒸汽滅菌鍋壓強降至大氣壓時，取出三角瓶，趁熱將三角瓶中的麩皮打散，再將三角瓶放置于無菌室，待溫度冷卻至室溫時分別接種霉菌3 mL 菌液，在無菌條件下攪拌均勻置于不同溫度下培養(yǎng)84 h，并且每隔24 h 進行無菌攪拌1次。

1.2.2 霉菌的復篩

通過菌株強化發(fā)酵生產清香型白酒。經品評和氣相色譜技術篩選獲取對清香型白酒品質具有影響的功能性霉菌。具體方法如下：將初篩獲得的霉菌制備成麩曲，測定其糖化力和液化力，通過強化發(fā)酵的方式，加入酒醅中，添加比例為5%麩曲和5%的大曲，采用“清蒸二次清，固態(tài)地缸發(fā)酵，甑桶蒸餾”的工藝獲取白酒。以傳統(tǒng)大曲清香型白酒生產工藝做對照。對蒸餾獲得的白酒進行品評，測定其理化指標、風味物質。由國家級品評酒師10名對蒸餾白酒進行感官品評。

采用氣相色譜技術測定風味物質，具體參考GB/T 10345—2007。

1.2.3 霉菌的鑒定

通過菌落、菌體形態(tài)觀察和分子生物學技術手段，對菌株進行鑒定。

1.2.4 制曲工藝的優(yōu)化

1.2.4.1 單因素試驗

（1）培養(yǎng)時間對麩曲糖化酶活力及液化酶活力的影響。將3 mL 孢子數為107～108cfu/mL 的霉菌孢子菌懸液接種于水分含量為50%的15 g 無菌麩皮中，混勻，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h和120 h，制備成麩曲，測定麩曲糖化酶活力，每組做3個平行。

（2）培養(yǎng)溫度對麩曲糖化酶活力及液化酶活力的影響。將3 mL 孢子數為107～108cfu/mL 的霉菌孢子菌懸液接種于水分含量為50%的15 g 無菌麩皮中，混勻，25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，測定麩曲糖化酶活力，每組做3個平行。

（3）水分含量對麩曲糖化酶活力及液化酶活力的影響。將3 mL 孢子數為107～108cfu/mL 的霉菌孢子菌懸液接種于水分含量分別為41%、44%、47%、50%、53%、55%的15 g 無菌麩皮中，混勻，35 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，測定麩曲糖化酶活力，每組做3個平行。

（4）孢子接種量對麩曲糖化酶活力及液化酶活力的影響。將1 mL、2 mL、3 mL、4 mL 和5 mL 孢子數為107～108cfu/mL 的霉菌孢子菌懸液接種于水分含量為50%的15 g 無菌麩皮中，混勻，35 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，測定麩曲糖化酶活力，每組做3 個平行。

1.2.4.2 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以制曲溫度、孢子接種量、培養(yǎng)時間和水分含量為響應變量，糖化酶活力為響應值，采用Box-Behnken 試驗設計，對霉菌所制麩曲進行響應面優(yōu)化組合，確定麩曲的最佳制作工藝條件。

1.2.5 麩曲理化指標的測定

（1）糖化酶活力的測定

糖化酶活力測定參照《釀酒分析與檢測》斐林試劑法[9]。

（2）液化酶活力的測定

液化酶活力測定參照《釀酒分析與檢測》碘化滴定法[9]。

（3）水分的測定

水分測定按照GB 5009.3—2010 執(zhí)行直接干燥法[10]。

（4）酸度的測定

酸度的測定參照GB/T 13662—2008 中和法，以乳酸的質量分數計[11]。

（5）孢子數的測定

孢子數的測定參照GB 4789.15—2010 霉菌和酵母計數法測定[12]。

2 結果與分析

2.1 霉菌的分離和初篩（圖1）

從酒醅中分離到5 株霉菌，分別為M1、M2、M3、M4和M5，并對這些菌株的產糖化酶活力進行了測定。由圖1 可知，M1、M2相比M3、M4和M5的糖化酶活力高，但相比對照菌株M0，M1、M2的糖化酶活力較低，糖化力在200～700 U/g；M3、M4均沒有明顯的糖化酶活力，M5糖化酶活力也較低。為此，后期以M1、M2為研究對象，進行復篩。

2.2 霉菌的復篩

將初篩獲得的霉菌M1、M2麩曲強化發(fā)酵酒醅，生產清香型白酒。由國家級品酒師對菌種強化發(fā)酵蒸餾白酒進行品評。由表1 可知，M1強化發(fā)酵組的白酒為清香型風格，但香氣較淡，帶腥膩，略有異味，酒體較綿柔，醇甜，尾子略苦澀，風味較差；M2強化發(fā)酵組的白酒屬清香型風格，香帶糧腥味，較醇厚，略雜，略顯醬味，酒體較綿柔，風味較好。由表2 可知，霉菌M1、M2強化發(fā)酵生產清香型白酒屬于清香型風格，但強化發(fā)酵對白酒的理化指標和主體骨架成分產生及含量和比例具有一定的影響。由于M2強化發(fā)酵白酒的品評結果優(yōu)于M1，為此，后期主要以菌株M2為對象開展研究。

圖1 不同菌株的糖化酶活力

表1 不同菌株強化發(fā)酵對白酒的感官影響

2.3 霉菌M2的鑒定

霉菌M2在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落圓形，邊緣整齊，致密絨毛狀；菌絲發(fā)達，生長快，生長初期呈疏松、白色，匍匐菌絲透明發(fā)達，后稠密，顏色變?yōu)榛疑▓D2）；菌絲無隔，菌體產黑色孢子囊，孢子較小，呈橢圓形或圓形。孢囊梗由生假根處的匍匐菌絲長出，多數成叢生、少數單生，囊軸呈圓形，無囊基、囊領，菌絲體無橫隔（圖3），M2的孢子色澤為黑色、橢圓形（圖4）。初步鑒定為根霉（Rhizopus）。

通過對菌株M2的ITS1-5.8SrDNA-ITS2 區(qū)域序列進行測序，與Genbank DNA 序列庫同源性序列比對發(fā)現，菌株M2與米根霉（R.oryzae）序列相似性為100%（表3）。

表2 菌株強化發(fā)酵酒醅對白酒理化指標及骨架風味物質的影響

綜合菌落、菌體特征和分子生物學鑒定，確定菌株M2為米根霉，將其命名為米根霉（Rhizopus oryzae）M2。見圖2、圖3、圖4。

2.4 霉菌M2麩曲工藝的優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗結果

（1）培養(yǎng)時間對糖化酶活力的影響。由圖5 可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株M2糖化酶活力呈先升高后下降的變化趨勢。菌株M2在培養(yǎng)時間24～72 h，糖化酶活力有所增加但變化幅度不大，；當培養(yǎng)時間達到84 h 時，糖化酶活力顯著增大，最大值為728 U/g；在培養(yǎng)時間84 h 之后，菌株M2的糖化酶活力又逐漸降低，但變化幅度不大。

圖2 菌株M2培養(yǎng)2d的菌落特征圖和培養(yǎng)4 d的菌落特征圖

圖3 M2菌體特征圖（10×40）

（2）培養(yǎng)溫度對糖化酶活力的影響。由圖6 可知，培養(yǎng)溫度在25～40 ℃之間時，隨著培養(yǎng)溫度的升高，M2糖化酶活力逐漸升高；當培養(yǎng)溫度為40 ℃時，M2的糖化酶活力達到最高值，為813 U/g；培養(yǎng)溫度為35～45 ℃時，菌株M2的糖化酶活力逐漸下降。

（3）水分含量對糖化酶活力的影響。由圖7 可知，隨著水分含量的增加，菌株M2的糖化酶活力在水分含量為50%～60%時，呈急速上升趨勢，當水分含量為60%時，M2的糖化酶活力達到最高值，為915 U/g；水分含量達到60%～70%時，菌株M2的糖化酶活力緩慢下降。

表3 霉菌M2ITS1-5.8Sr DNA-ITS2同源性序列比對結果

圖4 菌株M2的孢子（10×40）

圖5 培養(yǎng)時間對菌株M2糖化酶活力的影響

圖6 培養(yǎng)溫度對M2糖化酶活力的影響

（4）孢子接種量對糖化酶活力的影響。由圖8可知，隨著孢子接種量的增加，菌株M2的糖化酶活力呈先上升后下降趨勢，接種的菌液為1～3 mL時，糖化酶活力急劇上升；當孢子接種量為3 mL時，糖化酶活力達到最高值，為815 U/g；當接種量增加為3～5 mL時，糖化酶活力呈下降趨勢。

圖7 水分含量對菌株M2糖化酶活力的影響

圖8 孢子接種量對菌株M2糖化酶活力的影響

2.4.2 響應面試驗結果分析

在上述4 組單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken 的中心組合設計原理，選擇培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、水分含量和孢子接種量作為響應面優(yōu)化考察因素，以糖化酶活力為響應面Y 值，設計4 因素3水平試驗。試驗因素水平見表4，結果見表5，各因素的效應評價及系數估計見表6。

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2 中試驗數據進行二次線性回歸擬合，得到數學模型方程為：

對該模型進行方差分析，結果見表6。由表6可以看出D作用顯著，AC、BC、A2、B2、C2、D2作用極顯著。

由表7 回歸方程誤差統(tǒng)計分析可知，P 值＜0.01，表明該模型極顯著，且失擬項P=0.18＞0.05，表明不顯著，該模型在被研究的整個回歸區(qū)域內擬合性較好；R-Squared=0.9462，表明該方程相關性很好；該試驗C.V.%=2.23＜10，表明該試驗的可信度和精確度高；精確度Adeq Precision=12.516＞4，表明該模型是合理的。因此，該模型可以使用，適應性良好。

表4 Box-Behnken試驗因素表

表5 Box-Behnken試驗設計與結果

表6 回歸統(tǒng)計分析結果

表7 回歸方程誤差統(tǒng)計分析表

從圖9 等高線可以直觀地看出，A（時間）與C（水分）交互作用顯著。從圖9 三維立體可以看出，純種M2曲的糖化酶活力在合適的反應A（時間）和C（水分）下，具有最大值，該最大值出現在反應A（時間）值（84～90 h），C（水分）值（59%～61%）。

圖9 時間（A）和水分（C）交互作用對糖化力影響的響應面與等高線圖

從圖10 等高線可以直觀地看出，B（溫度）與C（水分）交互作用顯著。從圖10 三維立體中可以看出，菌株M2曲的糖化酶活力在合適的反應B（溫度）和C（水分）下，具有最大值，該最大值出現在反應B（溫度）值（40～41 ℃），C（水分）值（59%～61%）。

圖10 水分（C）和溫度（B）交互作用對糖化力影響的響應面與等高線圖

綜上所述，確定最佳試驗條件：培養(yǎng)時間為84.35 h，培養(yǎng)溫度為40.12 ℃，水分含量為59.86%，孢子接種量為2.78 mL，此時的預測糖化力為938.058 U/g。

2.5 驗證試驗結果

考慮到實際操作的可行性，將制曲條件修正為：培養(yǎng)時間為84 h，培養(yǎng)溫度為40 ℃，水分含量為60%，孢子接種量為3×107～108cfu/mL。該條件下實際生產的麩曲糖化力為917 U/g，符合預測值誤差范圍。

2.6 菌株M2麩曲的感官及理化指標分析

由圖11 可以看出，M2麩曲呈棕色，有光澤，疏松不易結塊。此時，麩曲的理化指標為：糖化力917 U/g，液化力0.72 U/g，水分含量8.34%，酸度0.84 g/L。

3 結論

圖11 菌株M2麩曲

本研究從傳統(tǒng)清香型白酒酒醅中分離篩選獲得1 株能賦予清香型白酒具有醬感的菌株M2；經過菌落、菌體特征和分子生物學鑒定，確定該菌株為米根霉（R.oryzae），該菌株具有產糖化酶和液化酶的能力。

以糖化酶活力為測定指標，在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken 試驗設計，通過響應面法優(yōu)化菌株M2制曲工藝，獲得最佳制曲工藝條件為：培養(yǎng)時間84 h，培養(yǎng)溫度40 ℃，水分含量60%，孢子接種數3×107～108cfu/mL，此時，菌株M2麩曲糖化力達到最大值，為917 U/g。

利用菌株M2所制備麩曲的理化指標為：糖化力917 U/g，液化力0.72 U/g，水分含量8.34%，酸度0.84 g/L。

以上研究為該菌株強化發(fā)酵應用于清香型白酒生產中，奠定了理論和應用基礎，也為白酒的可調控化、機械化和智能化的發(fā)展提供了菌種資源。后期應繼續(xù)基于風味導向技術，研究該菌株賦予白酒的特征物質，并對其形成機制作進一步研究。