納秋霞 舒燕 張毅 蔡樂 趙景云 宋娜麗

[摘要] 目的 從山豆根中分離鑒定內(nèi)生真菌。 方法 利用PDA培養(yǎng)基對山豆根進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離，采用分子生物學(xué)手段進(jìn)行鑒定，通過16S rRNA 基因序列分析，比對結(jié)果。 結(jié)果 從山豆根中分離得到35株內(nèi)生真菌，共9屬13種，鐮刀菌屬、間座殼屬、刺盤孢屬和青霉屬均為優(yōu)勢菌屬。 結(jié)論 山豆根中含有豐富的內(nèi)生真菌資源，進(jìn)一步開發(fā)利用山豆根中內(nèi)生真菌資源具有重要意義。

[關(guān)鍵詞] 山豆根;內(nèi)生真菌;鐮刀菌屬;亞隔孢殼屬

[中圖分類號] Q939.9;S567.19? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）21-0047-04

Isolation and identification of endophytic fungi from radix sophorae subprostratae

NA Qiuxia1 SHU Yan2 ZHANG Yi3 CAI Le2 ZHAO Jingyun1 SONG Nali1， 2

1.Central Laboratory， Yunnan Institute of Chinese Medicine， Kunming 650223， China; 2.School of Chemical Science and Technology， Yunnan University， Kunming 650091， China;? 3.Kunming Baker Norton Pharmace-utical Co.， Ltd.， Kunming 650100， China

[Abstract] Objective To isolate and identify endophytic fungi from radix sophorae subprostratae. Methods The endophytic fungi were isolated from the radix sophorae subprostratae by using PDA medium， and identified by molecular biological methods. The results were compared by 16S rRNA gene sequence analysis. Results 35 strains of endophytic fungi were isolated from the radix sophorae subprostratae， with a total of 9 genera and 13 species. Fusarium， Diaporthe， Colletotrichum and Penicillium were all dominant genera. Conclusion Radix sophorae subprostratae is rich in endophytic fungi resources， and it is of great significance to further develop and utilize the endophytic fungi resources in radix sophorae subprostratae.

[Key words] Radix sophorae subprostratae; Endophytic fungi; Fusarium; Didymella

山豆根為雙子葉植物綱豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep）的干燥根和根莖，是臨床常用的中藥之一[1]，其性味苦，寒，有毒，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱解毒、消腫利咽的作用。臨床上常用于火毒蘊(yùn)結(jié)、乳蛾喉痹、咽喉腫痛、齒齦腫痛、口舌生瘡等。山豆根生長環(huán)境特殊，喜高溫，大多生長于石山腳下、巖縫或灌叢林緣，主要分布于中國西南地區(qū)的云南、廣西、貴州、廣東、江西等溫度較高的省份，此外，越南也是山豆根的重要產(chǎn)區(qū)[2]。山豆根野生資源分布較為廣泛，但2003年以后，國內(nèi)以山豆根為原料提取苦參堿、氧化苦參堿等用于生產(chǎn)抗腫瘤、抗癌新藥，致使市場上山豆根的需求量迅速遞增，野生資源瀕危。山豆根化學(xué)成分豐富，藥理活性廣泛，具有較好的利用價值[3]。但目前的藥理作用研究主要集中在生物堿和多糖，有關(guān)黃酮、三萜類及其他成分的藥理作用報道較少，因此，山豆根值得深入研究，加強(qiáng)綜合利用和開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山豆根新鮮藥材于2018年7月采集于云南省文山州西疇縣，由云南省中醫(yī)中藥研究院主任藥師趙景云鑒定為山豆根，標(biāo)本保存于云南省中醫(yī)中藥研究院。實(shí)驗(yàn)用試劑NaClO溶液、乙醇購于昆明利健，青霉素、卡那霉素、無水硫酸鎂、葡萄糖購于西隴化工。

1.2 內(nèi)生真菌的分離與培養(yǎng)

1.2.1 分離培養(yǎng)基? 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：200 g新鮮馬鈴薯切塊用適量水煮沸30 min后，紗布過濾，濾液加20 g葡萄糖、15 g瓊脂（150 mg卡那霉素和150 mg青霉素）至充分溶解后，定容至1000 mL，分裝后，高壓滅菌鍋于121℃下滅菌30 min[4]。

孟加拉紅培養(yǎng)基：孟加拉紅0.333 g、氯霉素0.1 g、KH2PO4 1.0 g、瓊脂20.0 g、蛋白胨5.0 g、無水硫酸鎂0.5 g、葡萄糖10.0 g（150 mg卡那霉素和150 mg青霉素），攪拌加熱煮沸至完全溶解，定容至1000 mL，分裝后用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌30 min[5]。

1.2.2 山豆根藥材的前處理? 山豆根用自來水沖洗至水澄清，晾干后放置于超凈工作臺，進(jìn)行表面消毒：先將山豆根在5%的次氯酸鈉溶液中浸泡1 min，然后用滅菌過的超純水（UP水）沖洗3遍，再置于75%的乙醇溶液中浸泡1 min，取出后同樣用滅菌過的UP水沖洗3遍，最后用濾紙將山豆根表面的水分吸干[6]。

1.2.3 分離與培養(yǎng)? 剪刀、鑷子高壓滅菌，將山豆根塊根用剪刀去皮，剪碎成小塊，用鑷子將剪碎山豆根塊根平鋪在配置好的孟加拉紅培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基表面，每個培養(yǎng)基上均勻放置3塊，并初步固定，封口膜封好培養(yǎng)皿，放置于（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵化[7]。每隔24 h觀察1次，待菌落形成，在培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，將菌挑于單個PDA平板培養(yǎng)皿內(nèi)，重復(fù)此步驟至不能再挑出形態(tài)不一樣的菌落為止。根據(jù)菌落形態(tài)特征，采用平板梯度稀釋法分離、純化內(nèi)生菌，最后，將已純化的單一的菌株轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基，于（28±1）℃恒溫培養(yǎng)7 d[8]。

1.3 DNA的提取

將菌株接于PDA培養(yǎng)基中于25℃搖床恒溫培養(yǎng)72 h，收集新鮮的菌絲，用CTAB法對總DNA進(jìn)行提取[9]。方法如下：在1.5 mL的離心管中加入適量滅菌石英砂，挑取適量的菌絲，加入65℃預(yù)熱過的2XCTAB提取液250 μL進(jìn)行研磨，完畢后再加入2XCTAB提取液使最終體積為500～600 μL，在65℃下水浴30 min，間隔7～8 min翻轉(zhuǎn)混勻1次，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混合液，進(jìn)行震蕩，震蕩3～5 min后12000 rpm離心10 min[10]，將上清液取于另一無菌離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）混合液，進(jìn)行震蕩，震蕩3～5 min后，12000 rpm離心10 min，再取出上清液，加入2倍體積的無水乙醇，混勻后置于-20℃沉淀30 min，離心，棄上清液，重復(fù)操作，空氣干燥直到沉淀透明無色，加入30～50 μL無菌水溶解，-20℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.4分子生物學(xué)信息分析

對提取的DNA產(chǎn)物，進(jìn)行內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer）擴(kuò)增，結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology）數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序進(jìn)行比對[12]。菌種測序委托北京擎科生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果

對山豆根根部分離得到35株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS分子測定鑒定為7目9科9屬13種，從門和綱的層次看，分離得到的內(nèi)生菌子囊菌門糞殼菌綱較多（29株10種），占分離的菌株82.86%，屬于優(yōu)勢門（94.29%）和優(yōu)勢綱（82.86%），在目科屬種上具有豐富多樣性。在目的水平上，肉座菌目和格孢腔菌目為優(yōu)勢目，分別為9株和7株，分別為3個種和2個種，為優(yōu)勢目。在科的水平上，叢赤殼科、間座殼科、小叢殼科和曲霉科分別有2個種，分別分到了6、5、4和4株，叢赤殼科為優(yōu)勢科（占17.14%）。在屬的水平上，鐮刀菌屬分到了6株（占17.14%），亞隔孢殼屬分到5株，為優(yōu)勢菌屬。另外，還分到毛霉門Mortierellomycotina綱菌株2株1種。結(jié)果見表1、表2，可看出山豆根內(nèi)生真菌形態(tài)各異，種屬豐富。

3討論

自然界中菌種資源較多，以特殊生存環(huán)境內(nèi)生菌為重點(diǎn)研究的植物較有意義，尤其是在高寒、干旱、低緯度高海拔等極端環(huán)境中的植物內(nèi)生菌往往會產(chǎn)生特殊的生理功能和次級代謝產(chǎn)物，對于中藥材以及天然產(chǎn)物的研究具有重大應(yīng)用價值[13]。因此，從不同生態(tài)環(huán)境，尤其是特殊生態(tài)環(huán)境中篩選得到的中藥材內(nèi)生真菌，得到結(jié)構(gòu)高特異性、高活性物質(zhì)以及有效成分富集的幾率也將大大增加[14]。而且從中藥材根、莖、葉以及根際土壤等不同部位分離的內(nèi)生真菌，從種類和數(shù)量來講，從根部分離的內(nèi)生菌多于從莖、葉部分離的內(nèi)生菌，土壤中分離的內(nèi)生菌種類和數(shù)量也較多，與藥材化學(xué)成分、生長環(huán)境關(guān)系較密切，內(nèi)生菌種類和數(shù)量龐大而復(fù)雜，對其他植物化學(xué)成分結(jié)構(gòu)和活性影響較大[15-16]。植物內(nèi)生真菌生活在植物莖、葉柄、根和葉的細(xì)胞或細(xì)胞間隙中，物種多樣性豐富，能產(chǎn)生藥用成分和大量具有生物活性的產(chǎn)物[17]。植物與內(nèi)生真菌互利共生，關(guān)系密切，前者保護(hù)和喂養(yǎng)后者，后者“回報”生物活性（植物生長調(diào)節(jié)劑、抗菌、抗真菌、抗病毒、殺蟲等）物質(zhì)，以這樣的方式來增強(qiáng)宿主在自然界的競爭力，因此可以也可以作為道地藥材研究的重點(diǎn)對象。

在一些植物中，內(nèi)生菌參與某些重要次生代謝產(chǎn)物的合成，而另一些植物則是在內(nèi)生菌的刺激下合成特殊的次生代謝產(chǎn)物[18]。甚至內(nèi)生菌與宿主植物合成相同的次生代謝產(chǎn)物，從而增加植物中這一次生代謝產(chǎn)物的積累[19]。正是這些作用，導(dǎo)致不同內(nèi)生菌和植物相互作用，引起植物化學(xué)成分的富集或減少，甚至產(chǎn)生新的化合物，有助于人們篩選可富集有效成分的內(nèi)生菌，也便于尋找降低藥材毒性的內(nèi)生真菌，或者是從中發(fā)現(xiàn)新的次生代謝產(chǎn)物[20]。本研究后期將對山豆根中內(nèi)生真菌是否對其生物堿類有效成分苦參堿和氧化苦參堿的含量變化產(chǎn)生影響開展深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)從山豆根中分離得到了35株內(nèi)生真菌，共9屬13種，其中亞隔孢殼屬（Didymella glomerata）和鐮刀菌屬（Fusarium redolens）的菌株所占比例最大，為優(yōu)勢種屬;其次是間座殼屬（Diaporthe vaccinii），研究結(jié)果在一定程度上說明山豆根內(nèi)生真菌的生物多樣性，為后期內(nèi)生真菌的發(fā)酵改性奠定了較好基礎(chǔ)，進(jìn)一步開發(fā)利用山豆根內(nèi)生真菌資源具有重要意義。

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