張大眾，楊海川，菅明陽，隗書偉，趙 越，張一陽，丁 勤，馬翎健*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.河北省石家莊市藁城區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，石家莊 052160）

鎘（Cd）在土壤中有高度的遷移性，是最具有危害性的重金屬元素之一[1]。Cd可通過食物鏈傳遞進(jìn)而危害人的身體健康。小麥?zhǔn)俏覈饕Z食作物之一，且屬于抗Cd能力較強(qiáng)和易積累作物[2]。Cd脅迫會(huì)導(dǎo)致小麥株高、穗長和產(chǎn)量等生長指標(biāo)降低以及品質(zhì)的下降。大量試驗(yàn)表明[3-4]小麥Cd抗性存在較大的品種間差異。小麥Cd抗性又可以分為耐性（高濃度Cd條件下減小其毒害）和避性（減少吸收量）兩個(gè)途徑。早期研究也多是圍繞這兩個(gè)途徑展開，一方面研究Cd脅迫對小麥形態(tài)生理指標(biāo)的影響[5-7]和Cd積累分布特征，研究表明SOD、POD、CAT等保護(hù)性酶及脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與小麥Cd耐受能力相關(guān)，Cd在根部等器官和組織的特異積累能提高小麥Cd耐受能力；另一方面是低積累品種的篩選[8-9]。近年通過調(diào)控環(huán)境因素來降低Cd脅迫對小麥毒害作用的相關(guān)的研究逐漸增多[10-12]。從小麥自身Cd抗性出發(fā)并系統(tǒng)研究小麥在Cd脅迫下的形態(tài)生理響應(yīng)，Cd的吸收、積累分布特征以及不同抗性品種之間響應(yīng)方式差異的報(bào)道很少，單一水平揭示小麥Cd脅迫的響應(yīng)機(jī)制，不利于小麥Cd抗性的深入研究及相關(guān)性狀的改良。本研究通過比較不同濃度Cd處理及不同Cd抗性小麥品種間對Cd脅迫的形態(tài)、生理響應(yīng)以及Cd的積累、轉(zhuǎn)運(yùn)和化學(xué)形態(tài)分布，試圖初步探討小麥的Cd抗性機(jī)制，為小麥高抗和低積累Cd性狀的遺傳改良提供參考。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

盆栽試驗(yàn)用土取自西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)田，風(fēng)干后過篩并與營養(yǎng)土按一定比例混勻。土壤理化性質(zhì)：pH 8.0，速效氮 112.4 mg·kg-1，速效磷 38.2 mg·kg-1，速效鉀87.9 mg·kg-1，Cd 0.52 mg·kg-1。

試驗(yàn)所選用小麥品種為課題組前期通過發(fā)芽試驗(yàn)篩選出的Cd抗性不同但生育期基本一致的黃淮麥區(qū)小麥品種（系），發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯示其抗性水平為：許農(nóng)186較高，M1019和漯麥0603中等，西農(nóng)20較低。

1.2 試驗(yàn)處理

外源Cd 含量設(shè)置0、25、50 mg·kg-13個(gè)水平，按照相應(yīng)處理濃度及土壤質(zhì)量稱取CdCl2·2H2O溶于水中噴于土壤表面并不斷攪拌混勻。將處理后的土壤裝入塑料盆中，每盆裝土8 kg，澆足水穩(wěn)定30 d備用。各品種種子用30%H2O2消毒20 min后再用蒸餾水多次沖洗。將消毒后的種子種于裝滿相應(yīng)濃度Cd處理土壤的營養(yǎng)缽（10 cm×10 cm×10 cm）中，每盒種60粒，每個(gè)處理2盒，共24盒。于恒溫25℃、光照12 h的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，長至一葉一心轉(zhuǎn)移到3～4℃的培養(yǎng)箱春化一個(gè)月。苗期移苗到對應(yīng)Cd濃度的塑料盆中，每盆10株，每處理5盆，共60盆，在日光溫室培養(yǎng)至成熟。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 形態(tài)指標(biāo)調(diào)查

于成熟期測量株高，頂三葉面積（長×寬×0.75），莖、葉、穗干質(zhì)量（10株）和千粒重（500粒）。

生長抑制率=（1-處理/對照）×100%

1.3.2 生理指標(biāo)測定

（1）分別于苗期（苗期移苗時(shí)）、拔節(jié)期、灌漿期和蠟熟期取小麥頂部三片葉，存放于-80℃冰箱，測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及脯氨酸含量。因種子數(shù)量的原因，苗期所取樣品量較少，未進(jìn)行該時(shí)期SOD酶活性測定。

（2）分別于拔節(jié)期、開花期、灌漿期用葉綠素儀（SPAD502）測量小麥頂三葉葉綠素相對含量。

1.3.3 Cd的積累分布測定

（1）小麥各器官Cd積累量

于成熟期按處理取樣，用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗三次，吸水紙吸干表面水分，根部在20 mmol·L-1的Na2-EDTA溶液浸泡15 min除去表面的Cd。按根、莖、葉、籽粒分解，并于75℃烘干至恒質(zhì)量，籽粒陰干，各處理樣品粉碎過100目篩并稱取1 g用石墨消解儀消解，消解試劑為HNO3-HClO4（3∶1，V/V），用火焰石墨爐原子吸收光譜儀（Z-2000）測定Cd含量。

（2）小麥體內(nèi)Cd化學(xué)形態(tài)分析

于小麥灌漿期取各處理根和葉片用于化學(xué)形態(tài)分布測定。Cd化學(xué)形態(tài)分析采用化學(xué)試劑連續(xù)提取的方法[13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

本試驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)均使用Excel 2007和SPSS 19軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd處理對小麥表型性狀的影響

不同濃度Cd處理下各小麥品種的表型性狀如表1所示。許農(nóng)186和西農(nóng)20株高未隨Cd處理濃度的增加而顯著變化，M1019在25 mg·kg-1處理下株高有所增加，而漯麥0603在50 mg·kg-1處理下與對照相比株高顯著降低。各品種莖、葉、穗干質(zhì)量和千粒重隨Cd處理濃度的增加而降低，其中對葉片干質(zhì)量影響最大，50 mg·kg-1處理下降20%以上；25 mg·kg-1處理下許農(nóng)186、西農(nóng)20和M1019的頂三葉葉面積分別增大了8.6%、2.9%和7.21%，50 mg·kg-1處理下葉面積均顯著減小，其中漯麥0603降低最多為11.9%。各品種受抑制程度隨處理Cd濃度增加而增加，在25 mg·kg-1和50 mg·kg-1兩個(gè)處理下許農(nóng)186平均抑制率最低，漯麥0603最高，西農(nóng)20和M1019抑制率居中。

2.2 Cd處理下小麥的生理響應(yīng)

2.2.1 POD酶活性

由圖1可以看出各處理下小麥葉片POD酶活性隨處理時(shí)間的延長整體上呈降低趨勢。苗期各品種小麥葉片POD酶活性整體呈現(xiàn)隨Cd處理濃度升高而增加的趨勢，其中許農(nóng)186葉片POD酶活性最高，M1019最低。拔節(jié)期各處理葉片POD酶活性在各時(shí)期中最低，西農(nóng)20和M1019葉片POD酶活性仍隨Cd濃度的上升而顯著增加，且西農(nóng)20的POD酶活性在50 mg·kg-1條件下在同時(shí)期所有處理中最高；許農(nóng)186和漯麥0603的葉片POD酶活性隨Cd濃度的上升而顯著降低，且漯麥0603在同時(shí)期所有處理中酶活性處于較低水平，在50 mg·kg-1條件下達(dá)到最低。灌漿期和蠟熟期各處理葉片POD酶活性在25 mg·kg-1條件下最高，50 mg·kg-1條件下酶活性則顯著低于25 mg·kg-1下的水平，這兩個(gè)時(shí)期各品種在對應(yīng)Cd脅迫條件下POD酶活性以西農(nóng)20最高，漯麥0603最低。

表1 不同濃度Cd處理下各小麥品種農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic traits of wheat varieties under different concentrations of Cd

2.2.2 SOD酶活性

如圖2所示，除漯麥0603拔節(jié)期和灌漿期葉片SOD酶活性隨Cd處理濃度增加而增加外，其余各處理SOD酶活性均隨Cd處理濃度增加而降低，但較多處理間SOD酶活性差異不顯著。蠟熟期SOD酶活性低于灌漿期。

2.2.3 脯氨酸含量

由圖3可知，脯氨酸含量整體上隨Cd處理時(shí)間和處理濃度的增加呈上升趨勢，但增加幅度較小，多數(shù)處理之間差異不顯著。

2.2.4 葉綠素含量

各處理下不同時(shí)期頂三葉葉綠素含量的平均值如圖4所示。許農(nóng)186、西農(nóng)20和M1019頂三葉葉綠素含量隨生育進(jìn)程的推進(jìn)而升高并趨于穩(wěn)定，而漯麥0603在灌漿期葉綠素含量顯著下降。小麥各品種各時(shí)期葉綠素含量均隨Cd處理濃度的增加而降低。灌漿期25 mg·kg-1和50 mg·kg-1處理?xiàng)l件下各品種葉綠素含量顯著低于對照，且漯麥0603各處理間差異顯著。

2.3 各品種小麥Cd積累特征

圖5表明，Cd在四個(gè)品種小麥各器官中的含量隨Cd處理濃度的增加而升高，不同器官中Cd含量表現(xiàn)為：根＞葉片＞莖稈＞籽粒，且地上各部位遠(yuǎn)低于根，籽粒中的Cd含量遠(yuǎn)低于其他部位，50 mg·kg-1條件下籽粒中的Cd含量只占根部的2.2%～3%。西農(nóng)20和漯麥0603各器官Cd積累量均顯著高于許農(nóng)186和M1019。品種間不同部位Cd含量比值也表現(xiàn)出明顯差異，50 mg·kg-1處理下漯麥0603 Cd的葉片和籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最低，分別為21.2%和2.2%，西農(nóng)20葉片轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最高，分別為26.4%，西農(nóng)20和許農(nóng)186籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)較高，分別為3.02%和3.04%。

2.4 各品種小麥Cd化學(xué)結(jié)合形態(tài)

圖1 各處理下不同生育時(shí)期小麥葉片POD酶活性Figure 1 POD enzyme activity of wheat leaves at different growth stages under different treatments

圖2 各處理下不同生育時(shí)期小麥葉片SOD酶活性Figure 2 SOD enzyme activity of wheat leaves at different growth stages under different treatments

小麥葉片各提取態(tài)Cd含量如圖6所示。未處理?xiàng)l件下Cd各提取態(tài)間的分布相對均勻，隨Cd處理濃度的增加氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)占比增大，其余結(jié)合形態(tài)占比逐漸減小。未處理?xiàng)l件下氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)占比20%左右，其余化合態(tài)略低于上述兩種狀態(tài)。25 mg·kg-1脅迫條件下氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)分別占40%和30%左右，其余形式各占10%左右。50 mg·kg-1脅迫條件下氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)分別占50%和30%左右，其余形式都在10%以下。各品種的活躍態(tài)（乙醇、去離子水和氯化鈉提取態(tài)）Cd的比例有所差異，各處理?xiàng)l件下西農(nóng)20和漯麥0603相近且活躍態(tài)Cd占比較高，許農(nóng)186活躍態(tài)Cd占比最低。

圖3 各處理不同生育時(shí)期葉片脯氨酸含量Figure 3 Proline content in leaves of different growth stages

小麥根系各提取態(tài)Cd含量如圖7所示。分布情況與葉片中分布情況相似，但各處理下氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)Cd占比提高。

圖4 各處理不同時(shí)期頂三葉葉綠素含量相對值Figure 4 Chlorophyll content of top three leaves in different periods of treatment

3 討論

圖5 各處理小麥不同器官Cd積累量Figure 5 Cd accumulation in different parts of wheat under different treatments

圖6 小麥葉片各提取態(tài)Cd含量分配比例Figure 6 The percentage of each extractable forms of Cd in leafs of wheat

小麥不同表型性狀對Cd脅迫的響應(yīng)存在差異，25 mg·kg-1濃度Cd處理下對M1019的株高及西農(nóng)20、許農(nóng)186和M1019葉面積有促進(jìn)作用，即適宜濃度Cd脅迫對部分小麥的株高和葉片的生長有促進(jìn)作用，這與何俊瑜等[14]和王麗燕等[15]在Cd脅迫對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果相似，與聶勝委等[16-17]在Cd脅迫對小麥生長及產(chǎn)量研究中的結(jié)果基本一致，朱志勇等[18]的研究也表明50 mg·kg-1Cd處理下仍能促進(jìn)抗性小麥品種葉面積指數(shù)的增加，本試驗(yàn)中許農(nóng)186葉面積在50 mg·kg-1Cd處理下與對照差異不顯著。本試驗(yàn)中在葉面積增加的情況下相應(yīng)處理的小麥各器官干質(zhì)量仍下降，可能是由于光合機(jī)構(gòu)對Cd脅迫更為敏感，致使光合速率顯著下降，同化物質(zhì)減少[19-20]。Cd脅迫還能抑制籽粒貯藏物質(zhì)合成能力和胚乳細(xì)胞的分裂能力，導(dǎo)致籽粒庫容量減少，千粒重下降[21]。從表型性狀受抑制的程度可以看出四個(gè)品種Cd抗性表現(xiàn)為許農(nóng)186較強(qiáng)，M1019、西農(nóng)20次之，漯麥0603最弱，這與前期鑒定的結(jié)果基本一致。個(gè)別品種抗性的變化可能是因?yàn)椴煌龝r(shí)期抗性不一致。

圖7 小麥根系各提取態(tài)Cd含量分配比例Figure 7 The percentage of each extractable forms of Cd in roots of wheat

Cd對植物的毒害作用之一是損害生物體內(nèi)的酶及其化學(xué)性質(zhì)并誘發(fā)高活性自由基[22-23]。SOD、POD等是活性氧自由基清除系統(tǒng)中的重要保護(hù)酶。本試驗(yàn)中，POD在苗期活性較高，隨后活性迅速降低，且隨脅迫時(shí)間延長呈降低趨勢，在灌漿和蠟熟期25 mg·kg-1Cd脅迫下POD酶活性最高。許農(nóng)186、西農(nóng)20和M1019的SOD酶活性隨Cd濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長不斷降低?？赡苁且?yàn)镾OD和POD活性的提高是一種急性解毒措施，其調(diào)節(jié)能力是臨時(shí)和有限的，當(dāng)細(xì)胞長時(shí)間受到脅迫，細(xì)胞內(nèi)的酶也會(huì)受到損傷而使活性下降[24]。脯氨酸在植物體內(nèi)含量可以反映植物受脅迫程度的大小[25]，本試驗(yàn)中脯氨酸含量整體上隨Cd處理濃度和時(shí)間的增加而增加，即隨著處理濃度和時(shí)間的增加小麥?zhǔn)苊{迫的程度也不斷增加。本試驗(yàn)中SOD、POD酶活性和脯氨酸含量既表現(xiàn)出了相同的規(guī)律性也有品種間的差異，其中許農(nóng)186和西農(nóng)20的SOD、POD酶活性各時(shí)期都高于漯麥0603，西農(nóng)20的脯氨酸含量相對較高，而漯麥0603一直處于較低水平，這些抗性生理對Cd脅迫響應(yīng)程度的差異也是造成品種間Cd抗性差異的重要原因，這與何俊瑜等[26]的觀點(diǎn)一致。Cd脅迫對葉綠素含量和光合作用也有很大程度的影響，葉綠素含量高低也可以用來反映植物逆境下受傷害的程度。本試驗(yàn)中，隨Cd處理濃度的增加，葉綠素含量下降。拔節(jié)期頂三葉葉綠素含量低是因?yàn)轫敳啃鲁槌鋈~片光照時(shí)間短，葉綠素含量低。各品種以漯麥0603各處理間葉綠素含量差異最大，說明該品種對Cd脅迫最敏感。

Cd脅迫下小麥各個(gè)器官Cd含量隨處理濃度的升高而升高，不同器官含量不同[27-28]。本試驗(yàn)研究結(jié)果與文獻(xiàn)一致，小麥各器官Cd含量表現(xiàn)為根部＞葉片＞莖稈＞籽粒，與肖昕等[27]和馮紹元等[29]研究結(jié)果一致。Cd積累量在品種間表現(xiàn)出差異，西農(nóng)20和漯麥0603顯著高于許農(nóng)186和M1019，說明西農(nóng)20和漯麥0603應(yīng)對Cd脅迫的避性要低于許農(nóng)186和M1019；不同器官間分配比例也不同，根系和莖稈中漯麥0603 Cd含量最高，葉片和籽粒中則是西農(nóng)20含量最高。減少Cd的吸收，限制向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)是植物應(yīng)對Cd脅迫的重要防御方式[30]。西農(nóng)20表現(xiàn)出較高的Cd吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，是Cd抗性低的表現(xiàn)。漯麥0603則是高吸收、低轉(zhuǎn)運(yùn)，但其葉片和籽粒的絕對含量仍處于較高水平。

植物體內(nèi)的重金屬以不同的化學(xué)結(jié)合形態(tài)存在，其中乙醇提取態(tài)和水溶態(tài)遷移活性最強(qiáng)，氯化鈉提取態(tài)次之，醋酸和鹽酸提取態(tài)最弱[13]。無論在葉片還是根部乙醇提取態(tài)和水溶態(tài)Cd占比都隨處理Cd濃度的增加而降低，氯化鈉和醋酸提取態(tài)不斷增加。在葉片中許農(nóng)186的乙醇提取態(tài)和水溶態(tài)占比最少，漯麥0603占比最多，根中的分布情況與葉片相似。說明漯麥0603中活性高的Cd占比較多，在該方面對Cd的抗性較弱。

許農(nóng)186低吸收Cd，高活性的Cd的組分占比最少，生理響應(yīng)水平相對高，所以表現(xiàn)出了較高的Cd抗性；漯麥0603高吸收Cd，高活性Cd組分占比多，生理響應(yīng)水平低，所以表現(xiàn)出了較低的Cd抗性；西農(nóng)20和M1019的各個(gè)指標(biāo)響應(yīng)程度有強(qiáng)有弱，所以其抗性處于中間水平。從以上結(jié)果可以看出，小麥響應(yīng)Cd脅迫的防御方式很多，響應(yīng)方式也不盡相同，而抗性是所有生理機(jī)制作用的綜合體現(xiàn)。

4 結(jié)論

（1）四個(gè)小麥品種成株期Cd抗性表現(xiàn)為：許農(nóng)186抗性高，西農(nóng)20和M1019次之，漯麥0603較低。Cd脅迫在各器官中以對葉片干質(zhì)量的影響最大，一定濃度的Cd脅迫對部分小麥品種的株高和葉面積等有促進(jìn)作用。

（2）一定程度的Cd脅迫能提高POD酶活性，脅迫程度過高則表現(xiàn)為抑制，敏感型品種酶活性低；長時(shí)間Cd脅迫會(huì)降低SOD酶活性；脯氨酸含量隨Cd處理濃度和時(shí)間的增加而增高；葉綠素含量在Cd脅迫下降低。

（3）隨Cd處理濃度的增加，小麥通過提高低活性Cd的比例，來提高自身抗Cd脅迫的能力。

（4）不同小麥品種Cd吸收積累和分布的特征不同，對Cd脅迫的響應(yīng)也不同，但整體上表現(xiàn)為：抗性品種的Cd吸收量小、高活性Cd占比小、生理響應(yīng)的水平高。