楊 斌 李 燕 林美嬌 徐榮謙 方順順 楊冬妹 孫洮玉△

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

咳嗽變異性哮喘（CVA）是以咳嗽為唯一癥狀的特 殊類型哮喘。調(diào)查顯示，CVA發(fā)病率約占兒童慢性咳嗽的41.95%［1］，為兒童咳嗽的常見病因。據(jù)報道30%的CVA患兒會轉(zhuǎn)變?yōu)榈湫拖?］。CVA發(fā)病機制復(fù)雜，研究表明可能與遺傳、解剖、免疫、炎癥等多種因素有關(guān)［3］。近年來發(fā)現(xiàn)，上皮屏障功能的減退是引起CVA發(fā)生的高危因素［4-5］，因此，增強上皮細(xì)胞表面連接是防治CVA有效措施。加味芎蝎散是本文作者徐榮謙教授的經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用效果顯著，能夠降低氣道炎癥，改善通氣，降低復(fù)發(fā)發(fā)生率［6-7］。本研究擬通過觀察加味芎蝎散對CVA大鼠肺泡灌洗液炎細(xì)胞及肺組織形態(tài)學(xué)的影響，觀察細(xì)胞連接相關(guān)蛋白在大鼠支氣管黏膜上皮的表達情況，研究中藥對CVA的防治機理，并探索加味芎蝎散對支氣管黏膜組織的可能作用靶點?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量220～250 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由進食標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，自由飲水和攝食，自然光照，室溫（22±2）℃，濕度（40±10）%。

1.2 試藥與儀器 1）藥物：中藥加味芎蝎散，組成：川芎5 g，全蝎3 g，蘆根20 g，蓽茇1 g，半夏5 g，細(xì)辛1 g，五味子10 g，白前10 g（北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供），用中藥煎藥機煎制，制成煎劑，含生藥量3 g/mL。按大鼠體表面積換算，大鼠給藥劑量為0.5 g/（kg·d）。孟魯司特鈉片（杭州默沙東公司生產(chǎn)，規(guī)格4 mg/片，批號H37021289），取藥片溶于蒸餾水中，配制質(zhì)量濃度2 g/mL。卵蛋白OVA（美國Sigma公司，批號A5253-1009），Al（OH）3凝膠（美國Sigma公司，批號A8222-250）。2）試劑：白介素-33（IL-33）、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）試劑盒（美國 R&D Systems公司），E-cadherin抗體（英國abcam公司，貨號ab76055），緊密連接蛋白（ZO-1）（英國abcam 公司，貨號ab221547），Claudin3抗體（英國abcam公司，貨號ab15102），PV6000免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司），HRP標(biāo)記二抗、ECL發(fā)光液顯色（北京普利萊科技有限公司）。3）儀器：Olympus BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）；Image-Pro Plus 6.0軟件（美國Media Cybernetics公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 分組及造模 將40只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組10只與造模組30只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)文獻報道［8］及研究者既往造模經(jīng)驗建立CVA模型。具體方法如下：造模組首日肌注2%OVA 1 mL，腹腔注射20%Al（OH）31 mL，從第3周起，超聲波霧化器內(nèi)1%OVA溶液攻擊。每日1次，持續(xù)1周。當(dāng)大鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹肌收縮、咳嗽等形態(tài)學(xué)改變，確定造模成功；外周血中嗜酸性粒細(xì)胞百分比顯著高于空白對照組亦證明造模成功。30只造模組大鼠隨機分為模型組、孟魯司特鈉組以及中藥組，每組10只。

1.4 給藥方法 空白對照組與模型組以蒸餾水10 mL/（kg·d）灌胃，孟魯司特鈉組灌胃藥液10 mg/（kg·d），中藥組灌胃中藥液50 g/（kg·d），每日1次，共4周。各組大鼠均于末次給藥后收集腹主動脈血，頸部脫臼法處死，快速取出肺組織，左肺放入中性甲醛液中固定48 h待包埋，右肺下葉組織，約400 mg放入-70℃超低溫冰箱凍存。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）ELISA法檢測肺組織中TSLP、IL-33的含量：取20 mg左右凍存肺組織，加人200 μL生理鹽水低溫勻漿1 min，2次離心后，取上清得勻漿液，BCA試劑盒檢測濃度，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，加樣孵育、洗滌，酶標(biāo)抗體TSLP、IL-33孵育、洗滌，加HRP底物液顯色，終止反應(yīng)后，450 nm處檢測吸光度。2）各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察：中性甲醛液固定左肺上葉組織48 h，脫水、石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色后，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。3）免疫組化法測定E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達：左肺上葉組織石蠟包埋，4 μm切片，烘箱70℃烤片1 h，二甲苯、梯度乙醇脫蠟，3%的過氧化氫避光10 min以滅活內(nèi)源性酶；枸櫞酸鹽修復(fù)液（pH6.0）高壓熱修復(fù)3 min；滴加ZO-1、E-caderin、Claudin3抗體（濃度分別為1∶100，1∶400，1∶200），4 ℃冰箱孵育過夜滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG抗體（二抗），常溫孵育30 min，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，顯色后自來水洗，蘇木素復(fù)染，透明，封片。光鏡下觀察，陽性為支氣管黏膜上皮胞膜棕黃色顆粒，胞漿亦有少量表達，陰性對照用PBS代替一抗，每張切片隨機取5個高倍視野（400倍），Image-Pro Plus 6.0測定陽性信號的積分光密度（IOD）值。4）Western blotting測定E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達。冰上裂解右肺下葉組織約50 μg，勻漿器勻漿，BCA法測定各樣本的蛋白濃度，根據(jù)濃度計算并調(diào)整樣本為統(tǒng)一蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠和分離膠均為10%，濕法轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后室溫封閉，之后孵育相應(yīng)ZO-1、E-caderin、Claudin3一抗，濃度均為1∶1000，4℃孵育過夜，次日PBS-T清洗后，孵育HRP標(biāo)記的第二抗體1 h，ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光成像，保存數(shù)據(jù)為圖片，應(yīng)用Quantity One對條帶進行分析，用GAPDH為內(nèi)參，以比值結(jié)果作為目標(biāo)蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織中細(xì)胞因子表達水平 見表1。模型組大鼠肺組織中細(xì)胞因子IL-33、TSLP的含量均高于空白對照組，而中藥組和孟魯司特鈉組可以明顯抑制肺組織中IL-33、TSLP的上升。中藥組與孟魯司特鈉組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肺組織中細(xì)胞因子表達水平比較（ng/mL，±s）

表1 各組大鼠肺組織中細(xì)胞因子表達水平比較（ng/mL，±s）

與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與空白對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別空白對照組模型組孟魯司特鈉組中藥組n IL-3328.75±4.5447.63±6.80△△39.25±5.54*36.87±4.83**TSLP 115.52±17.80170.64±21.32△△148.66±23.53*143.33±20.49*

2.2 各組大鼠肺組織病理改變 見圖1。空白對照組支氣管、肺泡腔、間質(zhì)及血管均未見明顯炎癥浸潤，支氣管管腔內(nèi)未見分泌物，黏膜皺襞及黏膜上皮形態(tài)未見異常。模型組肺組織內(nèi)多量炎細(xì)胞浸潤，黏膜上皮層纖毛柱狀上皮細(xì)胞變性、脫落，黏膜皺襞變平，管腔內(nèi)可見黏液栓。孟魯司特鈉組以及中藥組可有模型組的表現(xiàn)，但較模型組均有明顯的減輕表現(xiàn)。

圖1 各組肺組織病理學(xué)改變（HE染色，100倍）

2.3 各組大鼠支氣管黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的免疫組化比較 見表2，圖2～4。E-caderin、ZO-1、Claudin3在氣道黏膜上皮、部分氣道平滑肌、血管平滑肌及個別肺間質(zhì)中呈胞膜及胞漿上棕黃色表達，本次實驗僅觀察并統(tǒng)計氣道黏膜上皮組織染色?？瞻讓φ战M中E-caderin、ZO-1、Claudin3表達較高，呈強陽性表達，而在模型組中呈弱陽性表達，表達量明顯減低（P＜0.01）。與模型組比較，孟魯司特鈉組和中藥組表達明顯增強（P＜0.05），但均弱于空白對照組。中藥組與孟魯司特鈉組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠氣道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達比較（IOD，±s）

表2 各組大鼠氣道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達比較（IOD，±s）

組別空白對照組模型組孟魯司特鈉組中藥組n E-caderin 25.35±2.7710.45±3.23△△18.35±3.09*17.59±2.46**ZO-122.65±6.859.21±2.48△△17.35±2.56*19.08±2.82*Claudin323.45±2.6912.69±2.86△△18.92±3.09*18.29±2.37*

圖2 各組E-cadherin免疫組化（100倍）

圖3 各組ZO-1免疫組化（200倍）

圖4 各組Claudin3免疫組化（200倍）

2.4 各組大鼠支氣管黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Cla-udin3蛋白表達比較 見表3，圖5?？瞻讓φ战M中E-caderin、ZO-1、Claudin3表達強度高，而在模型組中表達量明顯減低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，孟魯司特鈉組和中藥組表達量均有不同程度的增高（P＜0.05）。中藥組與孟魯司特鈉組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠氣道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達比較（目標(biāo)蛋白/內(nèi)參GAPDH，±s）

表3 各組大鼠氣道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達比較（目標(biāo)蛋白/內(nèi)參GAPDH，±s）

組別空白對照組模型組孟魯司特鈉組中藥組n E-caderin 0.81±0.070.68±0.08△0.75±0.09*0.74±0.06*ZO-10.80±0.060.62±0.08△△0.73±0.09*0.72±0.11*Claudin30.85±0.070.59±0.06△0.70±0.11*0.77±0.11**

圖5 各組肺組織E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達

3 討論

CVA是目前兒科領(lǐng)域較受關(guān)注的常見疾病，近年來隨著霧霾的加重，PM2.5的暴升，CVA在我國兒童的發(fā)病率呈急劇上升趨勢，除了發(fā)病率高，易轉(zhuǎn)化為典型哮喘外，最新研究發(fā)現(xiàn)，CVA患兒比典型哮喘更易出現(xiàn)情緒低落、焦慮、抑郁等心境變化［9］，嚴(yán)重影響著患兒及其家庭的生活質(zhì)量。因此，探索CVA潛在發(fā)病機制，開創(chuàng)有效的治療策略，有著積極而重要的臨床意義和社會意義。

CVA為Th1/Th2免疫失衡，Th2炎癥反應(yīng)占優(yōu)勢的氣道免疫炎癥性疾?。?0］。在變應(yīng)原和病原微生物的刺激下，氣道上皮細(xì)胞損傷后可釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，其中，細(xì)胞因子IL-33和TSLP是CVA Th2型炎癥反應(yīng)啟動的重要因素［11］。來源于上皮的細(xì)胞因子IL-33和TSLP可促進下游樹突狀細(xì)胞OX40L與CD4+T細(xì)胞膜上的OX40結(jié)合，使得CD4+T細(xì)胞向Th2亞群分化，上調(diào)Th2細(xì)胞因子的比例，增強Th2型免疫應(yīng)答［12-13］。本次研究通過ELISA法檢測肺組織中IL-33和TSLP的含量，發(fā)現(xiàn)CVA模型組氣道組織IL-33和TSLP明顯升高，而中藥組可以顯著抑制IL-33和TSLP的表達，且與模型組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；提示加味芎蝎散可能通過抑制Th2型細(xì)胞因子IL-33和TSLP的表達，緩解下游的免疫炎癥反應(yīng)。

上皮連接功能減弱或喪失是氣道上皮損傷的重要原因之一，E-caderin、ZO-1、Claudin3是發(fā)揮上皮屏障功能的重要細(xì)胞間連接蛋白。E-caderin是一類鈣離子依賴性跨膜糖蛋白，作用是保持上皮細(xì)胞間的粘附狀態(tài)，維持組織完整。既往研究表明，E-caderin在大多數(shù)炎癥中的表達均呈下調(diào)趨勢。近年來研究發(fā)現(xiàn)，E-caderin在哮喘患者及大鼠模型中的表達均明顯降低［14-15］，說明E-caderin可能與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)。ZO-1和Claudin3等構(gòu)成緊密連接蛋白復(fù)合物，在哮喘中亦表達下調(diào)。大量研究推測了連接蛋白對于哮喘發(fā)生及進展可能的機制：上皮連接蛋白表達下降后，上皮連接功能受損，支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，獲得了某些間質(zhì)細(xì)胞表型，從而造成了氣道重塑［16-17］。本次研究發(fā)現(xiàn)，CVA模型組中3種細(xì)胞連接蛋白表達均明顯下調(diào)，而中藥組和孟魯司特鈉組均有明顯的提高連接蛋白表達的作用，說明加味芎蝎散可能通過上調(diào)連接蛋白，維持細(xì)胞完整和上皮的屏障功能，抑制上皮細(xì)胞分泌Th2型細(xì)胞因子，達到緩解炎癥的作用。

芎蝎散出自宋代陳文中《小兒病源方論》，原方組成為川芎、蓽茇各1兩，蝎稍去毒尖1錢，細(xì)辛、半夏各2錢。萬全在《幼科發(fā)揮》中用芎蝎散治療“氣喘息急，嘔吐痰涎”者。CVA歷來是中醫(yī)治療的特色項目和優(yōu)勢病種。本文作者徐榮謙主任醫(yī)師在本病的發(fā)病機理中十分注重風(fēng)邪，同時，他又認(rèn)為，在CVA的發(fā)展過程中瘀阻肺絡(luò)也有重要的致病作用。故以芎蝎散為基礎(chǔ)，加白前、五味子、蘆根，組成加味芎蝎散。前期研究證實加味芎蝎散具有抗炎、抑制血管新生和細(xì)胞遷移作用。

本次研究結(jié)果顯示，加味芎蝎散能夠有效減輕CVA模型大鼠肺組織氣道炎癥程度，降低氣道黏膜上皮變性及損傷，在進一步的免疫組化和Western blotting實驗中均證明，中藥干預(yù)后，上皮連接相關(guān)蛋白的表達較模型組均有大幅提高。我們假設(shè)：加味芎蝎散能夠提高上皮連接相關(guān)蛋白的表達，穩(wěn)定了細(xì)胞間連接，從而改善了氣道的上皮屏障功能，繼而也削弱了哮喘的免疫炎癥反應(yīng)。該發(fā)現(xiàn)將為我們明確CVA黏膜上皮結(jié)構(gòu)功能改變以及加味芎蝎散治療CVA的作用機制提供研究基礎(chǔ)。