劉曉昆，陳文浩，劉洋*

1(北京科技大學 化學與生物工程學院，北京，100083)2(宜賓學院 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000)

芝麻香型白酒是我國的創(chuàng)新型白酒，具有濃香型、清香型、醬香型白酒的綜合風格，在風味上又別具一格，有著炒芝麻的特有香氣[1-2]。大曲是我國固態(tài)白酒釀造特有的糖化發(fā)酵劑，它不僅含有重要的粗酶和復雜的微生物區(qū)系，而且是決定其產(chǎn)品風味特征的香氣前體物質(zhì)等重要的生物活性物質(zhì)來源，在傳統(tǒng)白酒釀造過程中發(fā)揮重要的作用[3-5]。“好曲產(chǎn)好酒”，芝麻香型白酒特殊風味的形成亦離不開好曲，高溫大曲是芝麻香型白酒釀造的關鍵原料[6]，其為釀酒發(fā)酵富集了微生物[7]，這些微生物大多具有分泌淀粉酶、蛋白酶的能力，為芝麻香型白酒釀造提供了酶系和前體物質(zhì)，對芝麻香型白酒特殊風味的形成發(fā)揮至關重要的作用[8-9]。

16S rRNA基因序列廣泛應用于構(gòu)建細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，但在親緣關系很近的分類類群間，由于序列間的相似度太高而不能有效區(qū)分。其中，16S rRNA基因序列不能有效區(qū)分枯草芽孢桿菌屬的菌種[10]。但近年來研究者發(fā)現(xiàn)以編碼蛋白的DNA促旋酶A亞基基因(gyrAgene)[11]作為系統(tǒng)發(fā)育鑒定標記可以彌補16S rRNA基因的不足。隨機擴增多態(tài)性DNA標記(random amplifiea polmorphic,RAPD)是1990年WILLIAMS根據(jù)限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)法研究分子標記時提出的[12]。RAPD是建立在PCR(polymerase chain reaction)基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析的分子技術。其以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態(tài)核苷酸序列為引物，進行PCR擴增。對于不同模板DNA，用同一引物擴增總是有差異的，所以用RAPD就可以進行分子標記研究。理論上，在一定的擴增條件下，擴增的條帶數(shù)取決于基因組的復雜性。對特定的引物，復雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴增條帶數(shù)也越多。

本文利用傳統(tǒng)篩選方法從本實驗室提供的芝麻香型白酒制曲3個過程的細菌資源中篩選出產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶的菌株，利用16S rRNA和gyrA基因序列分析鑒定技術對其鑒定到種，并用RAPD分子分型技術對其在制曲過程中的動態(tài)演替進行追蹤。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

供試菌株為本實驗室前期在芝麻香型白酒大曲制曲3個關鍵階段分離獲得的細菌資源(表1)。

1.1.2 主要試劑

LB成品培養(yǎng)基，北京陸橋技術有限公司；引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)、BS-gyrA-F(5’- CAGTCAGGAAATGCGTACGTCTT-3’)、BS-gyrA-R(5’- CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3’)、PCR引物，北京諾賽生物公司；可溶性淀粉，西隴化工股份有限公司；分子生物學試劑，TIANGEN公司；脫脂奶粉、碘液，市售。

表1 大曲發(fā)酵過程中的理化指標和菌種數(shù)Table 1 Physicochemical index and number of strains during the process of Daqu fermentation

1.1.3 主要儀器與設備

精密恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；FTC-3000P實時熒光定量PCR儀，Canada Funglyn Biotech Inc；Bio-Rad GelDoc EZ凝膠成像系統(tǒng)，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶微生物的篩選

1.2.1.1 產(chǎn)淀粉酶微生物的篩選

將菌種接種在含1.0%淀粉LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)48 h后，在菌落周圍滴加碘液，如菌落周圍呈現(xiàn)透明圈時，表示菌種產(chǎn)生淀粉酶。若菌落周圍染成藍色，不出現(xiàn)透明圈者，說明該菌株不產(chǎn)生淀粉酶。

1.2.1.2 產(chǎn)蛋白酶微生物的篩選

將菌株分別劃線接種于含1.0%的脫脂奶粉的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈。

1.2.2 16S rRNA與DNA促旋酶A亞基基因(gyrAgene)序列分析

1.2.2.1 細菌基因組DNA提取

從平板上挑取細菌溶于30 μL無菌水中，先用沸水煮3 min，再放入-20 ℃冰箱中3 min，重復3次，離心，上清液中即含有細菌DNA。

1.2.2.2 16S rRNA與DNA促旋酶A亞基基因PCR擴增和序列測定

16S rRNA基因序列擴增引物：上游引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，下游引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)；gyrA基因序列PCR擴增引物：上游引物BS-gyrA-F(5’- CAGTCAGGAAATGCGTACGTCTT -3’)，下游引物BS-gyrA-R(5’- CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT -3’)。16S rRNA基因和gyrA基因的擴增條件均為94 ℃，5min；(94 ℃，1 min，55 ℃，1 min，72 ℃，1.5 min，35個循環(huán))；72 ℃，10 min。擴增體系見表2。擴增完成后，取10 μL PCR產(chǎn)物點樣1.0 %瓊脂糖凝膠電泳來確認PCR產(chǎn)物質(zhì)量。擴增產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

表2 16S rRNA和gyrA基因序列PCR擴增體系Table 2 PCR amplification system of 16S rRNA and gyrA gene sequence

1.2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序序列提交到GenBank，獲得接收號，并在EzTaxon server 2.1中進行比對分析[13]，以確定其與模式菌種的同源關系，并下載各模式菌種的有效序列。利用CLUSTAL W軟件進行多重序列比對后[14]，利用MEGA 7.0軟件使用鄰接法(neighbor-joining)進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[15]。

1.2.3 RAPD分子分型

使用1.2.2中提取的細菌基因組DNA為模板，利用RAPD分子分型技術對Q1B16、Q1B18、Q2B2、Q2B7、Q2B8、Q3B2、Q3B3、Q3B4八株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)進行菌株分型與動態(tài)演替的追蹤研究。使用的引物為OPA-02(5’-TGCCGAGCTG-3’)、OPA-18 (5’-AGGTGACCGT-3’)、OPL-07 (5’-AGGCGGGAAC-3’)、OPL-16(5’-AGGTTGCAGG-3’)、OPM-05(5’-GGGAACGTGT-3’)。擴增條件為95 ℃，5 min；(94 ℃，1 min，55 ℃，1 min，72 ℃，2 min，45個循環(huán))；72 ℃，10 min。擴增體系見表3。擴增完成后，取10 μL PCR產(chǎn)物點樣1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分析[16]。

表3 RAPD PCR擴增體系Table 3 PCR amplification system of RAPD

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶微生物的篩選結(jié)果

根據(jù)含1%的淀粉或脫脂奶粉的LB瓊脂培養(yǎng)基平板是否有透明圈，篩選出產(chǎn)淀粉酶的細菌5株，Q1B18、Q2B2、Q2B7、Q3B2和Q3B4；產(chǎn)蛋白酶的細菌9株，Q1B16、Q1B25、Q2B2、Q2B7、Q2B8、Q3B1、Q3B2、Q3B3和Q3B4；既產(chǎn)淀粉酶又產(chǎn)蛋白酶的細菌4株，Q2B2、Q2B7、Q3B2和Q3B4(表4，圖1和圖2)。

表4 產(chǎn)酶微生物的篩選結(jié)果Table 4 Screening results of enzyme-producing microorganisms

注：“+”，陽性；“-”，陰性。

圖1 產(chǎn)淀粉酶微生物在淀粉平板上形成透明圈 (加碘液顯色)Fig.1 Transparent circle of amylase-producing microorg- anisms on starch plate

圖2 產(chǎn)蛋白酶微生物在脫脂奶粉平板上形成透明圈Fig.2 Transparent circle of Protease-producing microorganisms on plate of skimmed milk powder

2.2 16S rRNA與DNA促旋酶A亞基基因序列分析結(jié)果

利用MEGA 7.0軟件使用鄰接法(neighbor-joining)對16S rRNA與DNA促旋酶A亞基基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析。16S rRNA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，所有可產(chǎn)酶菌株歸1個屬，即芽孢桿菌屬(Bacil-lus)(圖3)。gyrA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，所有可產(chǎn)酶菌株歸屬2個種，即枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillussubtilissubsp.subtilis)和貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，其中Q1B25、Q3B1歸屬為枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillussubtilissubsp.subtilis)；Q1B16、Q1B18、Q2B2、Q2B7、Q2B8、Q3B2、Q3B3、Q3B4歸屬為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)(圖4)。

圖3 大曲菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene of strain isolated from Daqu注：標尺代表0.5%的序列差異度

圖4 大曲菌株的gyrA基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene of strain isolated from Daqu注：標尺代表5%的序列差異度

2.3 RAPD分型結(jié)果

對Q1B16、Q1B18、Q2B2、Q2B7、Q2B8、Q3B2、Q3B3、Q3B4八株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)利用5種RAPD菌株分型引物OPA-02、OPA-18、OPL-07、OPL-16、OPM-05擴增結(jié)果的綜合分析，表明Q1B16、Q2B2、Q2B7、Q2B8、Q3B3為同一株型，Q1B18、Q3B2、Q3B4分屬于不同的株型(圖5)。Q1B16和Q1B18同分離于Q1期，但屬于同一株型；Q3B2和Q3B4同分離于Q3期，但不屬于同一株型，表明芝麻香型白酒高溫制曲過程中貝萊斯芽孢桿菌菌群發(fā)生了動態(tài)演替；Q1B16、Q2B2、Q2B7、Q2B8、Q3B3分別分離于制曲過程中的不同時期，但屬于同一株型，表明該株型的細菌具有縱向傳遞性，在制曲過程中發(fā)生了積累與傳遞。

DNA Marker；A-OPA-02；B-OPA-18；C-OPL-07；D-OPL-16；E-OPM-05圖5 RAPD產(chǎn)物電泳圖譜Fig.5 Electropherogram of RAPD product

3 結(jié)論與討論

大曲培養(yǎng)過程是釀酒過程中從自然環(huán)境中富集發(fā)酵菌株的主要途徑，里面不僅有酵母菌，還有細菌、霉菌[17]，但是隨著制曲溫度的逐步提高，酒曲中細菌發(fā)揮的作用卻越來越重要，其所進行的生理生化代謝活動產(chǎn)生的物質(zhì)和能量是制曲發(fā)酵的主要動力源泉，是形成大曲香味物質(zhì)的關鍵[18-20]。

細菌作為釀酒過程中的一類重要微生物，對提高釀酒產(chǎn)量，增強風味具有重要作用，一直是科研工作者的研究熱點。李永博等[21]以濃香型大曲為菌源，分離純化出一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，為進一步開發(fā)該菌株奠定了一定的基礎。TANG等[22]使用16S rRNA基因的V4高變區(qū)的高通量測序研究了茅臺和國泰大曲的細菌多樣性，發(fā)現(xiàn)雖然有些細菌的豐度不同，但這2種醬香型白酒大曲的細菌群落組成是一樣的。羅小葉等[23]從茅臺大曲中分離出了3株放線菌，對其進行形態(tài)學特征、生理生化實驗及分子生物學鑒定，并對菌株的產(chǎn)酶、產(chǎn)香特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)3株菌產(chǎn)果膠酶能力較為突出，其固態(tài)發(fā)酵揮發(fā)性成分以酯類物質(zhì)為主，且均能產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)。HE等[24]為研究強化大曲對濃香型白酒生產(chǎn)過程的影響利用Illumina MiSeq平臺分析了3種酒醅(FG)接種模式中微生物群落的差異，發(fā)現(xiàn)在FG50(傳統(tǒng)∶強化大曲=1∶1,w/w,50%強化大曲)中芽孢桿菌、乳球菌、曲霉和念珠菌的相對豐度較高，乳酸菌相對豐度較低，對制定有效的策略來調(diào)節(jié)釀造過程中的微生物并進一步改善中國白酒的風味有一定作用。

而對芝麻香型白酒的研究目前集中在菌落多樣性及分離鑒定的研究。曹宇等采用磷脂脂肪酸分析方法對芝麻香型白酒高溫大曲生產(chǎn)過程中微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化進行了研究，結(jié)果表明，真菌在整個制曲過程中占主導地位，細菌的含量和種類在第1次和第2次翻曲的過程中出現(xiàn)規(guī)律性變化，推測這2次翻曲在制曲過程中起著關鍵作用[25]。YAO等[26]從芝麻型白酒高溫大曲中分離出一種新型嗜熱菌種ThermoactinomycesdaqusH-18，并完成基因組測序。李斌等[27]基于Illumina Miseq測序方法研究了濃香型白酒中高溫酒曲和芝麻香型白酒高溫酒曲的微生物菌群結(jié)構(gòu)，并對酒曲中的細菌種類和豐度進行分析，結(jié)果表明，芝麻香型白酒高溫酒曲的優(yōu)勢類群主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)和別樣芽胞桿菌屬(Allobacillus)，其中別樣芽胞桿菌屬(Allobacillus)是首次在酒曲中發(fā)現(xiàn)且豐度較高的屬，其特性和功能尚不清晰，有待更加深入地研究。

本研究從本實驗室提供的從芝麻香型白酒高溫大曲中分離的細菌資源中篩選出產(chǎn)淀粉酶細菌5株；產(chǎn)蛋白酶細菌9株；既產(chǎn)淀粉酶又產(chǎn)蛋白酶細菌4株。采用分子生物學的鑒定技術確定了這10株菌歸屬于1個屬，即芽孢桿菌屬(Bacillus)；2個種，即枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillussubtilissubsp.subtilis)和貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，為增強白酒風味、提高白酒產(chǎn)量提供了菌種資源。在此之前，ZHI等[28]曾從多種白酒大曲中分離得到枯草芽孢桿菌枯草亞種，并用于白酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)生土臭味素的鏈霉菌屬的生物防治研究；WANG等[29]曾在研究高溫大曲是否對耐熱微生物有選擇性時也從高溫大曲中分離出貝萊斯芽孢桿菌。此外，本研究對8株貝萊斯芽孢桿菌的分子分型結(jié)果表明其屬于4個不同株型，表明芝麻香型白酒特殊風味的形成需要不同株系的貝萊斯芽孢桿菌共同起作用；且發(fā)現(xiàn)Q1B16、Q2B2、Q2B7、Q2B8、Q3B3為同一株型，表明其在制曲過程中具有縱向傳遞性，在芝麻香型白酒風味形成過程中可能起重要作用，本研究對芝麻香型白酒高溫大曲產(chǎn)酶細菌進行分離與鑒定，為下一步研究對芝麻香型白酒高溫大曲制曲過程中細菌群落的控制提供了理論基礎。