劉楚怡　樊雨梅　王長偉　梅娜娜　杜芬　王東亮

摘要 [目的]探索制備不同分子量驢骨肽的工藝，并通過細胞試驗對其抗骨質(zhì)疏松活性進行研究。[方法]以驢骨粉為原料，酶法制備不同分子量驢骨肽，通過單因素及響應面優(yōu)化得到最佳酶解條件，并考察其對成骨細胞MG-63中堿性磷酸酶活性的影響，確定具有抗骨質(zhì)疏松活性的不同分子量驢骨肽的制備方法。[結(jié)果]確定了平均分子量為3 315 Da和797 Da的驢骨肽的制備方法，可使成骨細胞的堿性磷酸酶活性分別增加9.84%和9.83%。[結(jié)論]該研究確定了小于3 kD和大于3 kD這2個分子量段中具有最佳抗骨質(zhì)疏松活性的驢骨肽的制備方法。

關(guān)鍵詞 驢骨肽;分子量;抗骨質(zhì)疏松活性;細胞試驗

中圖分類號 TS218文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0155-04

Abstract [Objective]To explore the preparation of different molecular weight donkey bone peptides and to study antiosteoporosis activities by cell experiments. [Method]The donkey bone powder was used as raw material to prepare donkey bone peptides with different molecular weight. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were optimized by single factor and response surface， and the effect on alkaline phosphatase activity of osteoblast MG63 was determined. To study the method for preparing different molecular weight donkey bone peptides against osteoporosis activity. [Result]Through the present study， the preparation methods of two molecular weight donkey bone peptides with average molecular weights of 3 315 Da and 797 Da were determined， and the alkaline phosphatase activities of osteoblasts were increased by 9.84% and 9.83%， respectively. [Conclusion]This study identified a method for the preparation of donkey bone peptides with optimal antiosteoporosis activity in two molecular weight segments less than 3 kD and greater than 3 kD.

Key words Donkey bone peptide;Molecular weight;Antiosteoporosis activity;Cell experiment

驢在我國具有悠久的飼養(yǎng)歷史，資源豐富。以驢皮為基本原料制作的阿膠，具有滋陰養(yǎng)血、補肺潤燥、止血安胎的療效，是久負盛譽的滋補藥[1]。然而，除驢皮外，驢血、驢骨、胎盤等加工副產(chǎn)物中也有很高的營養(yǎng)價值及應用價值[2]。驢骨中蘊含大量寶貴的營養(yǎng)資源，如驢骨膠原及其肽類、硫酸軟骨素等具有獨特生物活性的物質(zhì)[3]，可用于食品、化妝品生產(chǎn)中，具有很高的開發(fā)利用價值[4]。但目前，驢骨大多以骨粉等粗加工形式被少量利用，其余大多數(shù)都被廢棄并導致嚴重的環(huán)境污染。開發(fā)一種安全高效的從驢骨中制備活性驢骨肽的方法成了亟待解決的問題。

肽類化合物廣泛存在于自然界中，是指一類通過肽鍵連接氨基酸而成的化合物，它是機體組織細胞的基本組成成分。肽類特別是一些低聚肽，不僅具有比蛋白質(zhì)更好的消化吸收性能，而且還具有調(diào)節(jié)人體生理機能等作用。生物活性肽就是指一類介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間的分子聚合物[5]，具有增強機體防御功能、調(diào)節(jié)生命節(jié)律、預防疾病和促進康復等多種生物學功能[6]。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些具有改善骨質(zhì)疏松活性的肽，如魚骨膠原肽、龜鹿膠肽等，具有能夠增加骨密度、促進成骨細胞增殖及相關(guān)酶分泌[7-8]、改善骨質(zhì)疏松的活性。

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性的骨代謝疾病，具有骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退化、骨脆性增加等特征，常表現(xiàn)為患者骨密度下降、腰背疼痛、骨折等癥狀[9]。骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐年升高，目前全世界約有2億人患骨質(zhì)疏松癥，骨質(zhì)疏松癥已被公認為是僅次于心血管疾病的第二大健康殺手，已成為極為嚴重的公共健康問題[10]。

目前，國內(nèi)關(guān)于從驢骨中制備具有抗骨質(zhì)疏松活性的驢骨肽的研究鮮見報道，利用酶法開發(fā)具有生物活性的驢骨肽具有重要的理論意義和應用價值。筆者以驢骨粉為原料，酶法制備大于3 kD和小于3 kD這2種分子量的驢骨肽，并考察其對成骨細胞MG-63中堿性磷酸酶活性的影響，確定具有抗骨質(zhì)疏松活性的不同分子量驢骨肽的制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

驢骨粉，東阿阿膠股份有限公司;胰蛋白酶（10 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司;成骨細胞MG-63：武漢普諾賽生物科技有限公司;無水乙醇（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、三氯乙酸（分析純）、三氟乙酸（分析純）、硫化鈉（分析純）、乙腈（色譜純），北京化學試劑公司;3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、牛血清蛋白、維生素B12、谷胱甘肽及膠原蛋白，Sigma公司;Giemsa液，索萊寶公司。

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 1100型氨基酸自動分析儀，美國安捷倫公司;MSM2013實驗室用膜分離設(shè)備，上海摩速科學器材有限公司;UV-2010PC紫外可見分光光度計，尤尼克（上海）儀器有限公司;VersaMax Tunable Microplate Reader光柵式恒溫酶標儀，VersaMax Tunable公司;BX43熒光顯微鏡，Olympus公司。

1.2 酶解最適蛋白酶的篩選

選擇木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶等蛋白酶，分別在最適工藝條件下進行驢骨粉酶解試驗。酶解結(jié)束后，95 ℃滅酶。茚三酮法分別測定每一反應水解度，利用南京建成生物工程研究所的堿性磷酸酶試劑盒檢測細胞中堿性磷酸酶（AKP）活力。以水解度大小和AKP活力為指標，確定每種蛋白酶的酶解能力，篩選最適蛋白酶。

1.3 驢骨粉酶解條件優(yōu)化

通過單因素試驗對驢骨粉酶解的pH、溫度、底物濃度和加酶量等條件進行優(yōu)化。將驢骨粉加入蒸餾水配成不同濃度的驢骨粉溶液，用NaOH溶液分別調(diào)節(jié)到指定pH，按照一定加酶量分別加入胰酶，在指定溫度水浴中酶解3 h后，95 ℃滅酶，茚三酮法分別測定每一反應水解度，重復3次，結(jié)果取平均值。經(jīng)過酶的篩選，溫度、加酶量和pH的單因素條件篩選，并在單因素研究的基礎(chǔ)上，確定響應面優(yōu)化的條件。通過響應面分析最后獲得酶解最優(yōu)條件，并對最優(yōu)酶解條件下的酶解產(chǎn)物及膠原肽分別進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測。

1.4 成骨細胞MG-63的復蘇培養(yǎng)及傳代

達爾伯克（氏）必需基本培養(yǎng)基（DMEM）按照100單位/mL加入青霉素、鏈霉素，過濾除菌。0.25%胰蛋白酶：稱取0.25 g胰蛋白酶溶于100 mL PBS中，4 ℃過夜后使用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后冷藏于-20 ℃。

細胞培養(yǎng)：以DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為2×10 5個/mL的細胞懸液，接種于6孔板，每孔體積2 mL，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。貼壁24 h后棄培養(yǎng)液，分別加入含各種驢骨膠原肽的完全培養(yǎng)液。每組設(shè)置3個復孔，在37 ℃、5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d，每2 d換液一次。

1.5 分子量分布的測定

使用TSK GEL G2000SWXL色譜柱，通過高效液相色譜測定驢骨肽的分子量分布。檢測條件為以體積比1∶1的乙腈與0.2%三氟乙酸混合溶液為流動相，按0.5 mL/min的流速過柱，紫外檢測波長為225 nm。取牛血清蛋白、維生素B12、谷胱甘肽及膠原蛋白樣品各1 mg，分別溶于1 mL的純水中，用0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣。結(jié)果通過GPC軟件進行分析。

1.6 驢骨肽基本組成的測定

對驢骨肽的基本理化性質(zhì)進行檢測，包括蛋白質(zhì)含量、糖原含量、脂肪含量、水分以及灰分。采用的具體方法如下：蛋白含量的測定按照凱氏定氮法，根據(jù)國標GB/T 5009.5—2016測定;糖原含量的測定按照蒽酮比色法，根據(jù)GB/T 9695.31—2008測定;脂肪根據(jù)國標GB/T 5009.6—2016測定;水分根據(jù)國標GB 5009.3—2016測定;灰分根據(jù)國標GB5009.4—2016測定。

1.7 堿性磷酸酶（AKP）活性的測定

堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺可以測定酶活性的高低。按照南京建成生物工程研究所的堿性磷酸酶試劑盒說明書方法進行檢測。

AKP活性增長率=（添加肽后細胞AKP活性-未加肽前細胞AKP活性）/未加肽前細胞AKP活性×100%

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS軟件和Design expert軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解最適酶的篩選

使用7種蛋白酶在各自特定的最佳酶促水解條件下進行蛋白的酶促水解。由圖1可知，隨著酶解時間的增加，水解度逐漸增加，但水解度的增加趨勢逐漸減緩。當水解時間高于120 min時，胰酶和風味蛋白酶酶解效果顯著優(yōu)于其他酶，其中風味蛋白酶水解度最高。

由圖2可知，7種蛋白酶在各自特定的最佳酶促水解條件下水解3 h后，除胃蛋白酶外，AKP酶活力均顯著高于未酶解的驢骨膠原。并且，AKP酶活由高到低的順序依次為胰酶水解物、風味蛋白酶水解物、中性蛋白酶水解物、堿性蛋白酶水解物、木瓜蛋白酶水解物、菠蘿蛋白酶水解物、胃蛋白酶水解物，AKP酶活最高的水解物為胰酶水解物。選用胰酶和風味蛋白酶進行單因素條件優(yōu)化。

2.2 酶解條件優(yōu)化

通過單因素試驗選擇胰酶和風味蛋白酶酶解驢骨膠原的條件，分別考察pH、底物濃度、溫度和加酶量對酶解程度的影響（圖3）。

通過以上單因素試驗可以看出，在單因素的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert8.0.5中的Box-Behnken中心組合進行3因素3水平設(shè)計響應面試驗，以pH（A）、溫度（B）和底物濃度（C）為變量，其中pH選擇7、8、9，底物濃度選擇20、30和40 mg/mL，溫度選擇40、45、50 ℃，中心點重復5次共17個處理得到如下設(shè)計方案及結(jié)果。17個處理條件及結(jié)果如表1所示。

方差分析結(jié)果表明，該數(shù)學模型F值為4.10（P=0.038 2<0.05），達到了顯著水平，說明該方程的試驗點與結(jié)果相吻合，而失擬性檢驗F值為1.55（P=0.333 0>0.05），差異不顯著，表明方程沒有失擬因素，回歸方程的擬合較好，模型能夠反映真實的情況。

采用Design-Expert8.0.5統(tǒng)計分析軟件進行回歸優(yōu)化得到AKP增長率模型為：

AKP增長率（%）=8.58-0.055A-1.08B-0.19C-0.018AB-0.57AC+0.33BC+0.24A 2-1.26B 2-1.22C 2

圖4分別表示的是pH-溫度、pH-底物濃度、溫度-底物濃度對驢骨膠原蛋白水解物AKP增長率的影響。從各因素的分析可知，3個自變量（溫度、pH、底物濃度）均對AKP增長率有不同程度的影響。3個反應條件對AKP增長率的影響程度大小排序為提取pH、底物濃度、溫度?！癙rob > F”<0.05說明是模型中的顯著因素。分別對各因素相互作用對AKP增長率的影響進行試驗，得出試驗方案的最佳條件。以成骨樣細胞MG-63中AKP的分泌量為考察指標，驢骨膠原蛋白酶解的最優(yōu)條件為將胰酶按照4 000 U/g加酶量加入25.4 mg/mL底物中，調(diào)節(jié)pH至7.62，在48.03 ℃反應240 min，水解度為22.25%，AKP增長率為8.92%。采用優(yōu)選出來的最佳條件進行試驗驗證，得到的實際平均水解度為22.45%，AKP增長率為9.03%。實際試驗與理論值相差較小，因此Box-Behnken Design-響應面優(yōu)化驢骨膠酶解條件的優(yōu)化試驗可行，模型設(shè)計合理。

2.3 酶解時間對驢骨肽分子量及AKP增長率的影響 在前述得到的最佳酶解條件下，酶解不同時間，得到不同的酶解物，分析各產(chǎn)物對成骨樣細胞MG-63中AKP分泌量的影響及平均分子量。通過HPLC分析酶解產(chǎn)物，并通過GPC軟件分析對應酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布（表2）。發(fā)現(xiàn)加入2 000 U/g胰酶，酶解10 min的酶解產(chǎn)物，AKP增長率為9.84%，平均分子量為3 315 Da;加入2 000 U/g胰酶，酶解20～45 min，平均分子量為1 000～3 000 Da，其中AKP增長率最高的為酶解30 min時，AKP增長率為9.19%。

2.4 驢骨肽基本組成分析

按照國標方法分別對按照以上工藝制備的2種驢骨肽及驢骨粉的基本組成進行分析，其基本組成如表3所示。經(jīng)過以上工藝，驢骨肽中的蛋白含量從驢骨粉中的57.3% 增加到了87.6%和91.9%。在驢骨肽加工過程中，灰分也有了大幅降低，分別降低至1.4%和1.1%。另外，脂肪含量從10.5%降低到了6.2%和4.2%。在驢骨肽產(chǎn)品中，還存在部分未除去的脂肪及碳水化合物等物質(zhì)，這是因為在以上工藝過程中為了防止引入其他化學物質(zhì)增加其安全風險，并未進行脫脂步驟，這可以避免在驢骨肽制備過程中引入有害物質(zhì)。

3 結(jié)論

該研究得到具有最佳抗骨質(zhì)疏松活性的2種分子量的驢骨肽制備工藝，制備得到的大于3 kD驢骨肽粉平均分子量為3 315 Da，蛋白含量為91.9%，可使成骨細胞的堿性磷酸酶活性增加9.84%;小于3 kD驢骨肽粉平均分子量為797 Da，蛋白含量為87.6%，可使成骨細胞的堿性磷酸酶活性增加9.83%。

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