丁文文，王 樂，李飛躍，李 健，廖成水，劉志軍，薛 云，趙戰(zhàn)勤*

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/ 獸醫(yī)生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽471023；2.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院/ 微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽471023)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是巴氏桿菌科一種革蘭氏陰性的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴型菌，引起豬的副豬嗜血桿菌病，又稱Gl?sser 病[1]。該病以多發(fā)性漿膜炎(胸膜炎、腹膜炎、心包炎)、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等為病變特征，臨床表現(xiàn)為高熱，食欲不振，跛行，呼吸困難等癥狀。該病呈世界性分布，已成為全球范圍內(nèi)危害養(yǎng)豬業(yè)的最主要細(xì)菌性傳染病之一，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失[2]。HPS 的血清型較多，按Kieletein-Rapp-Gabrielson (KRG)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或間接血凝試驗(yàn)(IHA)對(duì)HPS 進(jìn)行血清分型，至少可以將其分為15 種血清型，但臨床20 %以上的分離菌株無法定型[3-4]。在世界范圍內(nèi)，該菌以4 型和5 型為主要流行血清型，其次是13 型、14 型等，但其時(shí)空分布也有明顯差異[5-7]。因此，及時(shí)掌握HPS 的流行病學(xué)分布和規(guī)律是防控該病的關(guān)鍵因素之一。

1992 年Kielstein 和Rapp-Gabrielson 建立的基于熱穩(wěn)定性抗原的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)[4]和2003 年Del Rio等建立的IHA 分型方法[3]，被認(rèn)為是HPS 分型的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，但這2 種方法仍有較多弊端，如部分分離株不能定型(20 %以上)，交叉反應(yīng)較強(qiáng)(不易判定)，抗血清不易制備等[8]。2015 年，Kate 等在獲得HPS 1 型～15 型莢膜合成基因的基礎(chǔ)上，分析其特異性靶點(diǎn)，建立了HPS 的PCR 分型方法。該方法能夠區(qū)分除5 型和12 型外的所有HPS 血清型，操作簡(jiǎn)單，能夠?qū)?00 %臨床分離菌株定型(150/150)。

豬呼吸道傳染病由細(xì)菌、病毒等多種因子引起，是目前規(guī)?；i場(chǎng)中常見和引起較大經(jīng)濟(jì)損失的豬病癥候群。在前期的研究中，本實(shí)驗(yàn)室分別報(bào)道了豬源多殺性巴氏桿菌和鏈球菌的病原流行病學(xué)情況及其分布規(guī)律[9-11]。本研究利用5 年時(shí)間，對(duì)河南及其周邊省份豬群開展大規(guī)模HPS 的分離鑒定并對(duì)研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，系統(tǒng)掌握近年來HPS 的病原流行情況與規(guī)律、血清型分布，及其協(xié)同感染情況，為客觀評(píng)估副豬嗜血桿菌病的危害及其綜合防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與實(shí)驗(yàn)材料 HPS 1 型～15 型參考菌株由澳大利亞昆士蘭大學(xué)Blackall P J 教授惠贈(zèng)；C 群馬鏈球菌獸疫亞種C55156 株、大腸埃希菌C83-1 株、多殺性巴氏桿菌C44-1 株、豬霍亂沙門氏菌C78-1株、豬丹毒絲菌C43-6 株和豬胸膜肺炎放線桿菌S1536 株均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心；支氣管敗血波氏桿菌LY-1 株由本實(shí)驗(yàn)室保存。HPS 1 型～15 型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、HPS 5 型和12 型參考陽性血清和熱穩(wěn)定性抗原均由本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)文獻(xiàn)[12]所述方法制備；胰蛋白大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白大豆肉湯(TSB)購自美國BD 公司；新生牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司； NAD 購自美國Roche公司；基因組提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 病料樣品采集與細(xì)菌分離 2445 份肺臟和不同數(shù)量的其它病料組織樣品來自2013 年～2017 年河南省及其周邊山西、湖北、安徽等省份的1024 個(gè)豬群，包括大、中、小型養(yǎng)殖場(chǎng)和各種類型的農(nóng)村散養(yǎng)戶，并對(duì)HPS 在不同年份和不同月份的分離率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。發(fā)病豬多表現(xiàn)為精神不振、食欲減退、被毛凌亂、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、皮膚及黏膜發(fā)紺甚至死亡等癥狀。為統(tǒng)計(jì)不同組織中HPS 的感染情況，本研究在采集肺臟(2445 份)的同時(shí)，部分豬采集心血(2341 份)、腦(313 份)、淋巴結(jié)(258 份)、肝臟(220 份)、脾臟(151 份)、關(guān)節(jié)液(470 份)等其它組織。將采集的病料樣品劃線接種于含新生牛血清(終濃度5 %)和NAD (終濃度10 μg/mL)的TSA 平皿，37 ℃培養(yǎng)24 h～48 h 后觀察，挑取各種優(yōu)勢(shì)菌落傳代純化和革蘭氏染色鏡檢。分離數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)基于以下原則：如果從同一病例不同病料組織樣品中均分離到HPS，則只統(tǒng)計(jì)其中一個(gè)病料組織樣品的分離菌株，分離優(yōu)先次序?yàn)槟X、心血、肺臟、淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、關(guān)節(jié)液。

1.3 HPS 及其共感染菌的PCR 鑒定 本實(shí)驗(yàn)所用PCR 引物詳見表1。按試劑盒說明書對(duì)疑似HPS、鏈球菌(Streptococcus，STR)、大腸埃希菌(Escherichia coli，EC)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，PM)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica，BB)、沙門氏菌(Salmonella，SAL)和豬丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathia，ER)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)的分離菌株分別提取細(xì)菌的基因組為模板分別進(jìn)行PCR 鑒定，鑒定為HPS 的菌株進(jìn)一步用HPS 1 型～15 型特異性引物進(jìn)行HPS 血清型的多重PCR 鑒定。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按表1 中參考文獻(xiàn)進(jìn)行。

1.4 KRG 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 由于已經(jīng)建立的PCR 分型方法不能將HPS 5 型和12 型區(qū)分開，所以進(jìn)一步使用KRG 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)PCR 鑒定為5 型或12型的菌株進(jìn)行5 型和12 型的血清型鑒定。方法如下：用生理鹽水洗脫待鑒定的5 型和12 型的菌苔至已滅菌的西林瓶中，121 ℃高壓處理2 h，10 000 r/min離心10 min，上清即為熱穩(wěn)定性抗原。KRG 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)操作方法：用打孔器在瓊脂平板上打孔，封底。中央孔加入HPS 陽性血清，周圍孔加入無菌PBS 2 倍倍比稀釋的待檢菌株熱穩(wěn)定性抗原，以加滿不溢出為宜，分別以制備的5 型和12 型陽性血清對(duì)應(yīng)血清型的熱穩(wěn)定抗原作為陽性對(duì)照，以PBS 為陰性對(duì)照。放入濕盒中，置于37 ℃，24 h 后觀察結(jié)果，應(yīng)連續(xù)觀察3 d。待檢菌株抗原孔與陽性血清孔之間出現(xiàn)清晰白色沉淀線來判定血清型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用方差分析(ANOVA)對(duì)HPS在2013 年～2017 年間的年分離率和月分離率進(jìn)行檢驗(yàn)，p＜0.05 表示差異顯著，p＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 HPS 的分離鑒定結(jié)果 通過細(xì)菌的分離鑒定，從采自不同省份的2445 份發(fā)病豬肺臟樣品和其它病料組織樣品中共分離出531 株HPS，總分離率為21.71 % (531/2445)。分離數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)原則參照1.2。對(duì)其中的217 株HPS 采用PCR 方法進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示，其中4 型最多，占28.57 %(62/217)；其次是5 型占17.51 % (38/217)、12 型占11.98 % (26/217)、13 型占8.29 % (18/217)、7 型占7.37 % (16/217)、14 型占5.53 % (12/217)、1 型占3.22 % (7/217)、2 型占3.22 % (7/217)；少數(shù)分離菌分別為3 型(2 株)、15 型(2 株)、8 型(1 株)、10 型(1株)、11 型(1 株)；未鑒定到6 型、9 型；另有24 株(11.06 %)未能鑒定出血清型(圖1)。結(jié)果表明，4 型和5 型是最流行的HPS 血清型，與以往的報(bào)道相比14 型的分離率有所降低，而7 型的分離率明顯增加，且已超過14 型。

2.2 HPS 在不同組織的分離結(jié)果 從發(fā)病豬不同組織器官分離的HPS 結(jié)果顯示，肺臟的HPS 分離率最高，達(dá)21.51 % (526/2445)；其次是心血(18.75 %；439/2341)、腦(18.21 %；57/313)、淋巴結(jié)(9.30 %；24/258)、關(guān)節(jié)液(7.87 %；37/470)、肝(6.82 %；15/220)；脾的分離率最低(5.96 %；9/151)(圖2)。結(jié)果表明HPS 最易導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)感染，也可以進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)造成全身性感染。

2.3 HPS 的流行特征分析結(jié)果 2013 年～2017 年5 年時(shí)間內(nèi)，HPS 在河南及其周邊省份的總分離率為21.71 % (531/2445)；不同年份的分離率介于18.12 %～30.31 % (圖3)。HPS 在不同月份的分離率介于15.64%～29.66%。1 月份分離率最高(29.66%)，除5 月份外，隨月份的增加分離率逐漸降低直到9月份的分離率最低(15.64 %)，之后隨月份的增加分離率又逐漸上升直到12 月份(26.87%)。這些數(shù)據(jù)表明，HPS 的分離率具有明顯的季節(jié)性；夏季(6 月、7 月、8 月)分離率最低，為16.67 %，冬季(12 月、1 月、2 月)分離率最高，為28.04 %，兩者的分離率差異極顯著(p＜0.01)(圖4)。結(jié)果表明，1 月～12 月HPS 的分離率具有明顯的季節(jié)性，冬季和春季HPS的分離率顯著高于夏季和秋季。

表1 本試驗(yàn)所用PCR 引物Table 1 PCR primers used in this experiment

圖1 217 株HPS 的血清型鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of serotype of 217 H.parasuis isolates by PCR

圖2 HPS 在不同組織的分離率Fig.2 Isolation rate of H.parasuis in different tissues

圖3 HPS 在不同年份的分離率Fig.3 Isolation rates of H.parasuis between 2013-2017

圖4 HPS 在不同月份的分離率Fig.4 Isolation rates of H.parasuis in different months between 2013-2017

2.4 HPS 共感染菌的分離鑒定及分析結(jié)果 在HPS 陽性的531 個(gè)病料樣品中，有217 份僅分離出HPS，未發(fā)現(xiàn)其它主要致病菌，占40.87%(217/531)；另外314 份同時(shí)分離出了各種不同的共感染菌，占59.13 % (314/531)。最常見的共感染菌是鏈球菌，占所有共感染菌的40.76 % (128/314)，其次是大腸埃希菌占30.89 % (97/314)、多殺性巴氏桿菌占13.69 % (43/314)、支氣管敗血波氏桿菌占9.87 %(31/314)和沙門氏菌占4.45 % (14/314)、豬丹毒絲菌占3.49 % (11/314)、胸膜肺炎放線桿菌占2.10 %(6/314)(表2)。在314 份共感染病料樣品中，有44份同時(shí)分離出3 種或3 種以上的共感染菌，占共感染病料樣品的14.01 % (44/314)。表明臨床豬群肺臟感染病原菌的種類較多且極其復(fù)雜。HPS 不僅與常見的呼吸道病原菌，如PM、BB 等共感染情況非常普遍，與其它常見病原菌的共感染情況也普遍存在。

3 討 論

HPS 在不同國家和地區(qū)的流行情況有一定差異，如北美最流行的血清型是4 型、5 型、13 型、7 型[5]，西班牙是5 型、4 型、2 型、13 型[6]，巴西是4 型、14 型、5 型、13 型[7]等。本研究利用PCR 分型方法對(duì)我國河南及其周邊省份近5 年分離的217 株HPS進(jìn)行了鑒定，顯示流行最廣泛的是4 型，其次是5型、12 型、13 型、7 型和14 型，未分離到6 型和9型。與2005 年Cai 等[18]、2010 年Zhou 等[19]、2012年Zhang 等[20]的報(bào)道情況相比，近年來HPS 流行最廣的仍然是4 型和5 型，但也發(fā)生了明顯變化，如14 型的分離率有所降低，而7 型的分離率明顯增加，且已超過14 型。目前的整體流行情況與2015年英國學(xué)者Kate 的報(bào)道比較一致[8]。本研究中僅有24 株(11.06 %)HPS 未能通過PCR 方法分型，但也顯著降低了傳統(tǒng)KRG 瓊脂擴(kuò)散分型方法和IHA 方法的不可分型比例(20 %以上)[3-4]。另外，分離結(jié)果還顯示，不僅在發(fā)病動(dòng)物的呼吸系統(tǒng)組織(如肺臟)分離到HPS，在發(fā)病豬的心血、腦、關(guān)節(jié)、淋巴結(jié)等組織中也能夠分離到該菌，表明HPS 不僅能夠感染呼吸道，而且也可以進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)造成全身性感染。

本研究對(duì)2013 年～2017 年HPS 的時(shí)間分布情況進(jìn)行了分析，不同年份HPS 的分離率介于18.12%～30.31 %，平均分離率為21.71 %。另外，HPS 的分離率具有明顯的季節(jié)性；夏季(6 月、7 月、8 月)分離率最低，冬季(12 月、1 月、2 月)分離率最高，且兩者差異極顯著(p＜0.01)；冬季和春季HPS 的分離率顯著高于夏季和秋季；這明顯不同于本研究室前期報(bào)道的豬源PM 和STR 的流行情況及其季節(jié)分布規(guī)律[9-11]。豬源PM 的分離率也有明顯的季節(jié)性，但有2 個(gè)高峰，分別為夏初(6 月)和冬初(12 月)[9]；豬源STR 的分離率在冬末(2 月份)和整個(gè)春季(3、4、5 月份)的分離率較高，另外在8 月也有一個(gè)小高峰[10-11]；這可能是因?yàn)槠鋵?duì)豬具有不同的發(fā)病機(jī)理以及對(duì)環(huán)境的抵抗力不同而導(dǎo)致的。

表2 HPS 協(xié)同感染菌的分離結(jié)果及時(shí)間分布Table 2 Isolation of pathogenic bacteria in detected samples co-infected with H.parasuis

目前，豬呼吸道傳染病是規(guī)?；i場(chǎng)中危害最大的疾病癥候群，可以由細(xì)菌、病毒等多種病原引起。HPS 是豬上呼吸道的一種共棲菌，在豬抵抗力較低的情況下侵入機(jī)體致病。同時(shí)，HPS 與其它病原的混合感染情況非常普遍，因?yàn)槠渑c多種細(xì)菌或病毒具有協(xié)同致病作用，如BB、STR、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2 型等[10,21-22]。本研究中，531 份分離出HPS 的病料樣品中，314 份(59.13 %)為HPS 與其它病原菌混合感染；最常見的共感染菌是STR，其次是EC、PM、BB 等，而分離到3 種或3 種以上共感染菌的比例達(dá)到14.01 %。表明在豬群中，HPS 與其它病原菌的共感染情況非常普遍。

本研究利用5 年時(shí)間開展大規(guī)模HPS 的分離鑒定和流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示其在豬群中的主要流行血清型為4 型、5 型、12 型、13 型、7 型、14 型，該病原的流行具有明顯的季節(jié)性，且與其它病原菌的共感染情況非常普遍。本研究為客觀評(píng)估副豬嗜血桿菌病的危害及其高效疫苗，特別是多價(jià)疫苗和多聯(lián)疫苗的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。