趙玉博，陳普成，胡玉珍，丁蕾蕾，王 波，焦晨晨，姜永萍，陳化蘭，柳金雄

(中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/ 農業(yè)部動物流感重點開放實驗室，黑龍江哈爾濱150069)

鴨病毒性腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又稱鴨瘟病毒，屬皰疹病毒，其基因組龐大，可供外源基因插入的復制非必需區(qū)多，是良好的活病毒載體[1]。

關于DEV 基因組復制非必需區(qū)的已有研究表明，UL27 與UL26 之間、LORF11 與UL55 之間、SORF3 與US2 之間和US7 與US8 之間的相關位點可以作為良好的外源基因插入位點[2-3]。因此，本實驗室前期在DEV 基因組US7 與US8 之間發(fā)現適合外源基因插入的位點，并構建出可作為疫苗株的重組病毒[4]。

反向遺傳操作技術可以在DNA 或RNA 水平對病毒基因進行修飾和改造，然后通過拯救出病毒的表型變化來判斷基因操作的效果，從而對病毒基因組表達調控機制、病毒致病的分子機理等進行研究[5-6]。

探尋DEV 基因組中可供外源基因插入的位點具有重要意義。為了探索其更多可利用位點，本研究利用反向遺傳技術，篩選到DEV 基因組復制非必需區(qū)適合外源基因插入的位點，為構建以DEV 為載體的疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 DEV 拯救系統(tǒng)的5 個粘粒(即pFosT、pFosH、pFosJ、pFosQ、pFosD)和重組質粒pENTR-SV40 由本實驗室構建并保存；DEV AV1222疫苗株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；DEV AV1221 強毒株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)；9 日齡～10 日齡SPF 雞胚和實驗所用的SPF 鴨均由哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑表達紅色熒光蛋白(RFP)的pDsred2-N1 質粒購自Clontech 公司；含有CCDB 基因的Gateway 試劑盒購自Invitrogen 公司；Q5 High-Fidelity DNA Polymerase、T4 Polynucleotide Kinase、SbfⅠ限制性內切酶、T4 DNA Ligase 均購自NEB 公司；DL2000、DL5000 DNA Marker 購自TaKaRa 公司；Plasmid Midi Kit 購自Qiagen 公司；膠回收試劑盒購自Omega 公司；轉染試劑TransIT-X2 Dynamic Delivery System 購自Mirus 公司；DH5α 感受態(tài)細胞、病毒DNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 重組質粒pENTR-SV40-RFP 的構建 根據RFP 基因(M96064.1)，設計擴增引物RFP-F/R(表1)，本實驗所用引物均由擎科生物技術有限公司合成。以pDsred2-N1 為模板，采用引物RFP-F/R 擴增含有RFP 的目的基因。PCR 反應條件為：98 ℃30 s；98 ℃10 s、56 ℃30 s、72 ℃2 min，35 個循環(huán)；72 ℃2 min。膠回收純化后即獲得含有RFP 的目的基因。利用EcoR V 酶切后將其連接至pENTR-SV40 質粒中，構建重組質粒pENTR-SV40-RFP。以RFP-F/R為引物，通過PCR 和測序鑒定該重組質粒。

1.4 重組粘粒pFosD-RFP 的構建 以含有CCDB基因的質粒為模板，采用引物CCDB-F/R (表1)進行PCR 擴增。PCR 反應條件為：98 ℃30 s；98 ℃10 s、56 ℃30 s、72 ℃2 min，35 個循環(huán)；72 ℃2 min。膠回收純化后即得到含有CCDB 的表達框。參照Gateway 系統(tǒng)的操作說明，先用E/T 克隆將該CCDB表達框插入到粘粒pFosD 基因組中，插入位點位于DEV 基因組UL 區(qū)的UL44.5 和UL44 的復制非必需區(qū)之間，得到含有CCDB 的重組粘粒pFosD-CCDB。利用LR 克隆技術將構建好的重組質粒pENTRSV40-RFP 與重組粘粒pFosD-CCDB 進行反應，得到含有RFP 的重組粘粒pFosD-RFP。通過PCR 方法和測序驗證重組粘粒pFosD-RFP 的構建是否正確。

1.5 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 的拯救及遺傳穩(wěn)定性的鑒定 利用SbfⅠ限制性內切酶將pFosT、pFosH、pFosJ、pFosQ 和pFosD-RFP 等5 個粘粒線性化處理，使用酚-氯仿方法回收酶切后的DNA 產物，參照磷酸鈣轉染方法分別將5 個線性化粘粒共同轉染次代雞胚成纖緯細胞(CEF)，連續(xù)傳至第10代，并且連續(xù)觀察紅色熒光表達情況。利用病毒DNA 提取試劑盒分別提取第5 代、10 代重組病毒感染CEF 細胞的總DNA，采用插入到DEV 基因組兩側的位點鑒定引物UL44.5-F/UL44-R (表1)進行PCR 擴增，鑒定重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 拯救情況及遺傳穩(wěn)定性。

1.6 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 的生長曲線滴定 將重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 和親本DEV 疫苗株以MOI 0.01 的劑量分別接種次代CEF，分別于接種24 h、48 h、72 h、96 h 后收集細胞和上清，完全凍融一次，充分震蕩混勻后離心，取上清滴加于96 孔板中，待5 d～6 d 后計算出每個時間點各病毒的TCID50。利用GraphPad 軟件制作重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 和野生型DEV 在CEF 中的生長曲線，并對重組病毒在CEF 中的增殖情況進行分析。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

1.7 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 免疫效力評價將2 周齡SPF 鴨分為3 組，8 只/ 組。第一組以105TCID50/ 只重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 進行免疫；第二組以105TCID50/只免疫DEV 疫苗株，作為陽性對照組；第三組免疫PBS (0.2 mL/只)，作為空白對照組(Mock-Con)。免疫14 d 分別用100LD50的DEV AV1221 株強毒攻擊。攻毒后連續(xù)觀察14 d，記錄各組鴨發(fā)病和死亡情況。

2 結 果

2.1 重組質粒pENTR-SV40-RFP 的構建與鑒定使用引物RFP-F/R 對構建的重組質粒pENTRSV40-RFP 進行PCR 鑒定，擴增產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，經擴增得到約1 600 bp的目的條帶，大小與預期相符(圖1)，測序結果也與預期相符。表明重組質粒pENTR-SV40-RFP 正確構建。

圖1 重組質粒pENTR-SV40-RFP 的PCR 鑒定Fig.1 Amplification of pENTR-SV40-RFP by PCR

2.2 重組粘粒pFosD-RFP 的構建與鑒定 對構建的重組粘粒pFosD-RFP 進行PCR 鑒定，擴增產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，經擴增得到約1 600 bp 的目的條帶，大小與預期符(圖2)，測序結果也與預期相符。表明重組粘粒pFosD-RFP 正確構建。

圖2 重組質粒pFosD-RFP 的PCR 鑒定Fig.2 Amplification of pFosD-RFP by PCR

2.3 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 的拯救 將pFosT、pFosH、pFosJ、pFosQ 和pFosD-RFP 5 個重組粘粒線性化后共轉染次代CEF 中5 d 后，利用倒置熒光顯微鏡觀察可見1 代、5 代、10 代重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 均有紅色熒光(圖3)，表明獲得遺傳穩(wěn)定的重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP。

圖3 重組病毒熒光表達情況Fig.3 Identification of recombinant viruses

分別提取第5 和10 代重組病毒細胞總DNA，利用引物UL44.5-F/UL44-R 經插入外源RFP 表達框的PCR 鑒定，結果顯示兩個代次重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 泳道均出現特異性的約1 600 bp 的目的條帶，對照組野生型DEV 中兩位點的泳道出現約300 bp 的條帶(圖4)。表明外源RFP 表達框插入DEV 基因組的UL44.5 和UL44 之間，并正確表達且穩(wěn)定存在。

圖4 重組病毒的PCR 鑒定結果Fig.4 Identification of recombinant viruses by PCR

2.4 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 生長曲線滴定結果 將rDEV-ul44.5ul44RFP 和DEV 以MOI 0.01的劑量接種CEF，接種后每隔24 h 滴定其TCID50，并繪制其生長曲線。結果顯示，該重組病毒和親本DEV 在CEF 中的復制無顯著性差異(圖5)，表明在DEV 基因組UL44.5 和UL44 之間插入外源基因后，外源基因可以正確表達，且對重組病毒在細胞中的生長無明顯影響。

圖5 重組病毒和DEV 在CEF 中的生長曲線Fig.5 Growth curve of the recombinant viruses and DEV in CEF

2.5 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 免疫效力評價結果 將DEV 疫苗株和重組病毒rDEV-ul44.5 ul44RFP 分別以105TCID50免疫SPF 鴨，免疫后2 周利用DEV 強毒攻擊。結果顯示， DEV 疫苗株、重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 均能夠對DEV 強毒攻擊的SPF 鴨提供100 %保護；空白對照組(Mock-Con)SPF 鴨發(fā)病率死亡率均為100 % (圖6)。表明利用反向遺傳操作技術構建的重組DEV 具有良好的免疫原性，DEV 基因組UL 區(qū)的UL44.5 和UL44 之間可以用作構建表達外源基因重組病毒的理想位點。

圖6 重組病毒免疫后對DEV 強毒攻毒的保護效力Fig.6 Protective efficacy of the recombinant viruses against DEV

3 討 論

DEV 弱毒活疫苗自60 年代以來在多個國家廣泛使用，對預防DEV 具有良好的保護效果。DEV作為理想的重組病毒載體，具有免疫后幾小時即可產生堅實的免疫保護，且不受母源抗體的干擾[7]。隨著近些年基因組序列和基因功能研究的不斷深入，以DEV 為載體表達其它抗原的疫苗研究報道逐漸增多[8-11]，該策略主要是通過篩選DEV 復制非必需區(qū)進行外源基因的表達，從而構建重組病毒，并通過相關評價確定其作為疫苗候選株的可行性。

相關研究者將1 型和3 型鴨肝炎病毒表達VP1蛋白的基因通過2A 序列串聯(lián)后，插入DEV C-KCE株UL27 與UL26 基因之間，構建的重組疫苗rC-KCE-2VP1 能夠產生快速的免疫反應[12]。Wang 等利用細菌人工染色體(BAC)技術，將H5N1 亞型禽流感病毒HA 基因插入DEV C-KCE 株UL55 基因內部構建得到重組疫苗[13]。胡玉珍等獲得了DEV 兩個可供外源基因插入的復制非必需區(qū)，分別位于us7基因內部、us8 和us1 基因之間，并構建了兩株重組病毒[14]。本研究構建了重組病毒rDEV-ul44.5 ul44RFP，病毒經過連續(xù)傳代至第10 代，經鑒定表明外源基因在該位點可以穩(wěn)定遺傳；表達的紅色熒光表明，插入的RFP 基因能夠穩(wěn)定表達；重組病毒在CEF 中的生長曲線顯示，該株重組病毒的生長特性與DEV 疫苗株無顯著差異，說明外源RFP 基因的插入不影響重組病毒的增殖特性。重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 以105TCID50免疫SPF 鴨，攻毒保護結果顯示，SPF 鴨在免疫14 d 后均能夠誘導對DEV 強毒攻擊的保護，保護效率均為100 %。這些結果表明，UL44.5 和UL44 基因間隔區(qū)是DEV 基因組的一個復制非必需區(qū)。鴨瘟病毒UL44 位于鴨瘟病毒基因組UL 區(qū)，其ORF 長1 296 bp，編碼431個氨基酸的glycoprotein C (gC)。gC 能夠免與補體C3b 受體片斷結合，參與免疫逃避過程，抑制補體的激活途徑，保護病毒不被抗體和補體中和。DEV UL44.5 基因的ORF 長813 bp，編碼270 個氨基酸的蛋白。關于新位點插入外源RFP 基因是否干擾其兩側UL44.5、UL44 和病毒其它基因的功能性表達有待于進一步研究。

本研究鑒定出UL44.5 和UL44 基因間隔區(qū)是DEV 基因組的一個復制非必需區(qū)，更加完善了DEV 基因組的信息，同時為利用該位點構建以DEV 為載體的疫苗奠定基礎。