范 振，孫軍峰，趙 冉，韓宗璽，劉勝旺

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/ 禽呼吸道病創(chuàng)新團(tuán)隊，黑龍江哈爾濱150069)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)的M蛋白位于病毒的囊膜內(nèi)層，是一種非糖基化的膜蛋白。M 蛋白一部分鑲嵌在囊膜內(nèi)，另一部分與病毒的核衣殼相互作用，構(gòu)成囊膜的支架[1]。M 蛋白主要參與病毒的組裝以及出芽[2]。其能夠與宿主細(xì)胞膜、病毒囊膜糖蛋白的胞質(zhì)區(qū)以及核衣殼相互作用參與病毒粒子的組裝[3]。M 蛋白的突變導(dǎo)致F 蛋白不能包裝進(jìn)入病毒粒子中，從而不能形成有感染性的病毒[4]。早期研究認(rèn)為NDV 感染后在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，但后續(xù)研究顯示，在NDV 感染細(xì)胞早期，M蛋白能夠在細(xì)胞核和核仁中聚集，并且在整個感染過程中持續(xù)存在于核仁中[5]；而在感染的后期，M蛋白進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)與病毒核糖核蛋白復(fù)合體(RNP)、糖蛋白以及細(xì)胞膜相互作用完成病毒粒子的裝配和出芽[6]。上述研究表明，NDV的M 蛋白是一種細(xì)胞質(zhì)-核穿梭蛋白。最近研究顯示，M 蛋白R42A 突變后，導(dǎo)致其不能進(jìn)入到細(xì)胞核中，而且病毒的復(fù)制和致病性也被減弱。此外，宿主細(xì)胞核仁磷蛋白B23 能夠與NDV M 蛋白相互作用從而使M 蛋白定位于細(xì)胞核中；對B23 進(jìn)行沉默后，能夠減少NDV 引起的細(xì)胞病變并抑制NDV 的復(fù)制，表明宿主因素在NDV 的復(fù)制過程中發(fā)揮著重要的作用[7]。

然而，到目前為止，NDV M 蛋白在細(xì)胞質(zhì)- 核中穿梭的動態(tài)變化及對病毒復(fù)制的生物學(xué)意義仍然知之甚少。尤其是NDV 感染以及M 蛋白細(xì)胞質(zhì)-核穿梭如何調(diào)控宿主細(xì)胞的生物學(xué)過程來促進(jìn)NDV自身的復(fù)制尚未有報道。本研究利用反向遺傳技術(shù)拯救獲得了攜帶TC 標(biāo)簽的M 基因的重組NDV La Sota 病毒，通過雙砷染料對帶有TC 標(biāo)簽的M 蛋白進(jìn)行染色，實現(xiàn)了M 蛋白在NDV 感染細(xì)胞過程中細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中的動態(tài)運輸?shù)目梢暬O(jiān)測。本研究為進(jìn)一步探究M 蛋白在NDV 感染中的作用及其分子機(jī)制提供新工具。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 BSR T7/5 和DF-1 細(xì)胞由本實驗室保存并培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10 %胎牛血清的DMEM；穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA 聚合酶的重組痘病毒vTF-3 和NDV La Sota 疫苗株由本實驗室保存；9 日齡SPF 雞胚和1 %雞紅細(xì)胞由本研究所實驗動物中心提供。

含NDV La Sota 株全長cDNA 的質(zhì)粒pNDFLsp及編碼NDV NP、P 和L 蛋白的輔助質(zhì)粒pCI-NP-K、pCI-P-K 和pCI-L-K 由本實驗室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)mega 公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購自NEB 公司；RNA 提取試劑盒、DNA Marker、pMD18-T 載體、E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞、Prime-ScriptTMOne Step RT-PCR Kit、One Step SYBR Prime-Script RT-PCR Kit 購自TaKaRa 公司；KOD-Plus-Neo高保真聚合酶購自TOYOBO 公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購自Sigma 公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen 公司；FlAsH-EDT2 染料試劑盒購自Invitrogen 公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 pNDFLsp 載體中M 基因編碼區(qū)位于5 235 nt～6 329 nt，其兩側(cè)可用的酶切位點為PmeⅠ(5 166 nt～5 173 nt)和NotⅠ(6 897 nt～6 904 nt)。參照pNDFLsp 載體序列，利用Primer 軟件設(shè)計2 對特異性引物(表1)，引物由北京華大基因公司合成。

表1 擴(kuò)增攜帶TC 標(biāo)簽的M 基因所用的引物Table 1 Primers used for construction of M gene containing TC tag

1.4 攜帶TC 標(biāo)簽的重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以pNDFLsp 為模板，采用引物M5155/M6915，PCR 擴(kuò)增包含PmeⅠ和NotⅠ酶切位點的片段，對應(yīng)pNDFLsp 中5 155 nt～6 915nt 片段。擴(kuò)增獲得目的片段，簡稱為A 片段，經(jīng)電泳檢測并回收。以片段A為模板，使用引物M5155/M-CTC-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得B 片段；以片段A 為模板，采用引物M-CTC-F/M6915 PCR 擴(kuò)增獲得C 片段。將B、C 片段分別回收，再以這兩個片段為模板通過融合PCR 獲得末端帶有TC 標(biāo)簽的M-CTC 片段。將M-CTC 片段與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個克隆采用引物M5155/M6915 經(jīng)菌液PCR 鑒定，陽性質(zhì)粒由北京華大公司測序鑒定，測序正確的質(zhì)粒命名為pMD18T-M-CTC。pMD18T-M-CTC 經(jīng)PmeⅠ和NotⅠ雙酶切，回收酶切后片段與經(jīng)同樣雙酶切的pNDFLsp 載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆提取質(zhì)粒后用PmeⅠ和NotⅠ酶切鑒定并測序，獲得M 基因C 末端帶有TC 標(biāo)簽的NDV La Sota 的全長cDNA，命名為pNDFL-M-CTC。

1.5 重組標(biāo)記病毒La Sota-M-CTC 的拯救與鑒定用穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA 聚合酶的重組痘病毒vTF-3 接種六孔板中的BSR T7/5 細(xì)胞，1 h 后參照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明，將質(zhì)粒pNDFL-M-CTC及輔助質(zhì)粒pCI-NP-K、pCI-P-K 和pCI-L-K 以4∶2∶1∶1的比例轉(zhuǎn)染BSR T7/5 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后6 h 換成含10 %胎牛血清的DMEM，并補(bǔ)充阿拉伯糖苷(0.2 μg/mL)以及TPCK 胰酶(5 μg/mL)。培養(yǎng)72 h 后收集細(xì)胞及上清混合后接種9 日齡的雞胚尿囊腔，72 h 時收集尿囊液采用紅細(xì)胞凝集試驗(HA)[8]檢測其HA 效價。收獲HA 效價高于4 log2 的尿囊液，提取其RNA，采用引物M5155/M6915 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增并測序。獲得的病毒命名為LaSota-M-CTC，分裝后-70℃凍存。

1.6 La Sota-M-CTC 的純化 采用有限稀釋法純化拯救病毒。用PBS 將La Sota-M-CTC 10 倍倍比稀釋，將其中10-7～10-9共3 個稀釋度的尿囊液分別接種5 枚雞胚，棄掉24 h 內(nèi)死亡的雞胚，37 ℃孵化72 h 后檢測雞胚尿囊液的HA 效價，將10-9稀釋的尿囊液接種雞胚獲得的尿囊液HA 價最高的命名為F1 代，繼續(xù)將F1 代病毒以10-7～10-9稀釋度的尿囊液分別接種5 枚雞胚，重復(fù)上述步驟獲得的HA 價最高的尿囊液命名為F2 代。再以同樣方法連續(xù)稀釋純化病毒，收獲F3 代病毒尿囊液，過濾后分裝，-70 ℃凍存。

1.7 La Sota-M-CTC 雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測定 將拯救獲得的La Sota-M-CTC，以及親本病毒La Sota 尿囊液10 倍倍比稀釋，將10-7～10-9各稀釋度的尿囊液分別接種5 枚雞胚，37 ℃繼續(xù)孵化72 h，通過測定感染雞胚尿囊液的HA 活性來判斷其是否感染，利用Reed-Muench 法計算La Sota-M-CTC 和親本病毒La Sota 的EID50。

1.8 La Sota-M-CTC 的毒力測定 將1.6 純化后的La Sota-M-CTC 以及親本病毒La Sota 尿囊液用無血清的DMEM 10 倍倍比系列稀釋，選取4 個稀釋度(10-6～10-9)，每個稀釋度的病毒接種5 枚9 日齡SPF 雞胚，0.1 mL/ 胚，置37 ℃培養(yǎng)。每天照胚兩次，棄去24 h 內(nèi)死亡雞胚，連續(xù)觀察7 d，記錄各雞胚的死亡時間，并分別收集各胚尿囊液測定其HA 值，計算雞胚平均致死時間(Mean death time，MDT)。

1.9 La Sota-M-CTC 的遺傳穩(wěn)定性檢測 將1.6純化后的La Sota-M-CTC 通過尿囊腔途徑接種9 日齡SPF 雞胚，72 h 時收獲尿囊液繼續(xù)以相同方法傳代，共連續(xù)傳15 代。取P1、P5、P10 和P15 代尿囊液提取RNA，采用引物M5155/M6915 進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物測序鑒定，檢測TC 標(biāo)簽是否穩(wěn)定存在。

1.10 La Sota-M-CTC 的生長動力學(xué)曲線的測定將La Sota-M-CTC 以及親本病毒La Sota 按100 EID50/0.1 mL 劑量接種SPF 雞胚，分別在接種后24 h、48 h、72 h、96 h 取樣，每個時間點隨機(jī)抽取3 枚雞胚，測定病毒的EID50，并繪制病毒的生長動力學(xué)曲線。

1.11 M 蛋白的激光共聚焦檢測 將La Sota-MCTC 以MOI 1 感染DF-1 細(xì)胞，37 ℃孵育1 h 后用PBS 洗滌3 次后加入10 %胎牛血清的DMEM 和TPCK 處理過的胰酶(1 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)，1 h 后棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次后用2.5 μmol/mL FlAsHEDT2 雙砷染料(綠色)室溫避光染色30 min。洗滌2次后，用4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)對細(xì)胞核染色，室溫避光20 min 后，置激光共聚焦顯微鏡下觀察M 蛋白的表達(dá)盒分布。

2 結(jié) 果

2.1 攜帶TC 標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pNDFL-M-CTC 的構(gòu)建與鑒定 以pNDFLsp 為模板，使用引物M5155/M6915 經(jīng)PCR 擴(kuò)增包含PmeⅠ和NotⅠ酶切位點的片段，結(jié)果顯示，獲得約1 700 bp 的條帶，與預(yù)期大小一致，以該片段為模板，使用引物M5155/M-CTC-R 擴(kuò)增片段A，獲得約1 100 bp 的一條目的條帶(圖1)。以引物M-CTC-F/M6915 擴(kuò)增片段B，獲得約600 bp 的一條目的條帶(圖1)。將上述A 和B 片段分別回收，再以這兩個片段為模板通過融合PCR 的方法擴(kuò)增獲得約為1 700 bp 的目的條帶，與預(yù)期一致(圖1)，表明獲得M 基因C 端帶有TC 標(biāo)簽的片段，命名為M-CTC。

圖1 C 端帶有TC 標(biāo)簽的M 基因片段的構(gòu)建Fig.1 Construction of M gene fragment containing TC tag in the C-terminal of its coding region

將M-CTC 片段克隆至pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后采用菌液PCR 檢測，結(jié)果顯示，獲得約1 700 bp 的目的條帶，經(jīng)測序正確的質(zhì)粒命名為pMD18T-M-CTC。將該質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ和NotⅠ雙酶切，克隆至pDNFLsp 載體中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ和NotⅠ雙酶切得到了分別約為15 000 bp 的pNDFLsp 載體條帶和約為1 700 bp 的M-CTC 目的條帶，與預(yù)期相符(圖2)，測序結(jié)果顯示TC 標(biāo)簽序列正確，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pNDFL-M-CTC。

圖2 重組質(zhì)粒pNDFL-M-CTC 的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid named pNDFL-M-CTC

2.2 La Sota-M-CTC 的拯救及鑒定 將重組質(zhì)粒pNDFL-M-CTC 與輔助質(zhì)粒pCI-NP-K、pCI-P-K 和pCI-L-K 共轉(zhuǎn)染BSR T7/5 細(xì)胞，收獲細(xì)胞及上清接種SPF 雞胚，72 h 提取收獲尿囊液中病毒的RNA，經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增并測序。結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得的目的條帶經(jīng)測序結(jié)果顯示M 基因編碼區(qū)C 末端存在引入的TC 標(biāo)簽(圖3)，表明拯救獲得的標(biāo)記病毒La Sota-M-CTC 中含有引入的TC 標(biāo)簽。將拯救獲得的病毒純化后，通過HA 試驗測定La Sota-M-CTC的HA 效價為29，接種雞胚測定La Sota-M-CTC 的EID50為109.08/0.1 mL。親本病毒La Sota 的血凝效價為29，EID50為109.29/0.1 mL。

圖3 La Sota-M-CTC 標(biāo)簽序列測定Fig.3 Sequencing the tag of La Sota-M-CTC

2.3 La Sota-M-CTC 的毒力及遺傳穩(wěn)定性測定結(jié)果 通過接種雞胚測定La Sota-M-CTC 致死雞胚的MDT，結(jié)果顯示La Sota-M-CTC 的MDT 為102 h，親本病毒La Sota 株為100 h，NDV 毒力指標(biāo)判定中MDT＞90 h 的病毒屬于低毒力，本研究結(jié)果表明重組病毒和親本病毒均屬于低毒力病毒，且TC 標(biāo)簽的插入不影響重組病毒的毒力。為測定TC 標(biāo)簽在病毒中的穩(wěn)定性，將La Sota-M-CTC 連續(xù)傳15 代后，經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增并測序，結(jié)果顯示，P1、P5、P10 和P15 代中均檢測到約1 700 bp 的目的條帶(圖4A)。并且測序結(jié)果顯示TC 標(biāo)簽在傳15 代后的La Sota-M-CTC 基因組仍然中存在(圖4B)。表明TC 標(biāo)簽?zāi)軌蚍€(wěn)定存在于La Sota-M-CTC 病毒基因組中。

圖4 TC 標(biāo)簽在La Sota-M-CTC 中的遺傳穩(wěn)定性的PCR 檢測結(jié)果(A)和測序結(jié)果(B)Fig.4 Results of the genetic stability of TC tag in La Sota-M-CTC detected by PCR (A)and sequencing (B)

2.4 La Sota-M-CTC 的生長動力學(xué)測定結(jié)果 將拯救病毒La Sota-M-CTC 和親本病毒La Sota 接種9日齡SPF 雞胚，在不同時間收獲病毒，測定病毒EID50并繪制其生長動力學(xué)曲線。結(jié)果顯示，La Sota-M-CTC 與La Sota 在SPF 雞胚中的生長動力學(xué)水平相似，二者的EID50均在72 h 左右達(dá)到峰值，拯救病毒與親本病毒的生長特性無明顯差異(圖5)。表明TC 標(biāo)簽對病毒的復(fù)制增殖無影響。

2.5 La Sota-M-CTC 感染細(xì)胞后M 蛋白的動態(tài)分布檢測結(jié)果 將La Sota-M-CTC 接種DF-1 細(xì)胞后，通過雙砷染料FlAsH 對活細(xì)胞染色。激光共聚焦結(jié)果顯示，在接種La Sota-M-CTC 1 h～2 h 時，M 蛋白(綠色熒光標(biāo)示)主要分布于細(xì)胞質(zhì)中(圖6A)，而在接種后4 h M 蛋白進(jìn)入細(xì)胞核中，并持續(xù)存在至病毒感染后的12 h (圖6B)。表明M 蛋白中的TC標(biāo)簽?zāi)軌虮浑p砷染料染色，通過對染色的TC 標(biāo)簽的追蹤可以對NDV 感染后M 蛋白在活細(xì)胞中的定位分布進(jìn)行監(jiān)測；M 蛋白在NDV 感染后的早期階段即可進(jìn)入細(xì)胞核中并且能夠持續(xù)存在于細(xì)胞核中。

圖6 激光共聚焦觀察M 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的的動態(tài)分布Fig.6 The dynamic distribution of M protein monitored by via confocal microscopy

3 討 論

M 蛋白是NDV 病毒粒子中位于囊膜內(nèi)層的非糖基化蛋白，副粘病毒中的M 蛋白主要通過與其它病毒蛋白的相互作用參與病毒粒子的組裝過程[6,9]。由于文獻(xiàn)報道M 蛋白末端的氨基酸殘基組成可能會影響病毒的組裝效率[6]，本研究在構(gòu)建重組病毒時分別將TC 標(biāo)簽插入M 基因編碼區(qū)起始密碼子的前方，以及終止密碼子的前方。將構(gòu)建的含有TC 標(biāo)簽的全長pNDFL-M-CTC 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠分別拯救獲得M 蛋白N 末端和C 末端攜帶TC 標(biāo)簽的重組病毒，但是N 末端攜帶TC 標(biāo)簽的重組病毒滴度要低于C 末端攜帶標(biāo)簽的重組病毒(本研究發(fā)現(xiàn))，表明N 末端TC 標(biāo)簽的存在可能影響了病毒的組裝或釋放過程，因此本研究選擇構(gòu)建了C 末端攜帶標(biāo)簽的病毒以進(jìn)行進(jìn)一步的試驗。對傳15 代后的病毒經(jīng)測序顯示，TC 標(biāo)簽?zāi)軌蚍€(wěn)定存在于重組病毒中，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。該病毒在SPF 雞胚中的生長動力學(xué)曲線與親本病毒相似，表明M 蛋白攜帶TC 標(biāo)簽不影響病毒的生長特性和復(fù)制，且該重組病毒可以作為一種標(biāo)記病毒用來監(jiān)測M 蛋白在細(xì)胞中的運輸。

病毒在感染后需要依賴宿主細(xì)胞的生物學(xué)過程來完成自身的復(fù)制。近年來越來越多的研究表明，在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的RNA 病毒能夠編碼病毒蛋白并定位至細(xì)胞核中從而干擾宿主細(xì)胞的功能以促進(jìn)病毒自身的復(fù)制[10-14]。副粘病毒中的呼吸道合胞體病毒(RSV)的M 蛋白能夠在感染的早期定位于細(xì)胞核中抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，推測M 蛋白可能在RSV 誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯中起關(guān)鍵作用[15]。進(jìn)一步的研究證實RSV 對細(xì)胞周期的干擾作用確實是由M 蛋白定位至細(xì)胞核中所介導(dǎo)實現(xiàn)的[11]。前期研究報道NDV的M 蛋白能夠定位于細(xì)胞核中，但是M 蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的動態(tài)分布以及M 蛋白的核定位對宿主細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚不清楚，本研究通過反向遺傳技術(shù)拯救獲得了M 蛋白攜帶TC 標(biāo)簽的重組病毒，通過激光共聚焦顯微鏡實時監(jiān)測M 蛋白的定位分布，顯示M 蛋白在感染后的4 h 即可進(jìn)入細(xì)胞核并存在至感染后的12 h。M 蛋白的細(xì)胞核定位是否能夠調(diào)控細(xì)胞周期、是否能夠抑制宿主細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而促進(jìn)病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及病毒組裝釋放，還有待于進(jìn)一步深入的研究。