熊俊垚，趙 款，于 芳，楊勇博，田志軍，蔡雪輝，安同慶

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150069)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS 病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的以妊娠母豬繁殖障礙和仔豬呼吸癥狀為主要特征的傳染病。該病流行范圍廣，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。我國(guó)于1996 年首次分離到PRRSV，即CH-1a 株[1]。隨后幾年中，PRRSV 蔓延到我國(guó)各主要養(yǎng)豬省份。2006 年，我國(guó)暴發(fā)了高致病性PRRS (Highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，其具有傳播迅速、發(fā)病率和死亡率高等特點(diǎn)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

PRRSV 屬于動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬成員。其基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約15 kb，5' 端有帽子結(jié)構(gòu)，3' 端有poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)，基因組至少編碼9 個(gè)開(kāi)放性閱讀框(Open reading frames， ORFs)， 包括 ORF1a、 ORF1b、 ORF2、ORF2a、ORF3～ORF7[3-4]。在PRRSV 復(fù)制過(guò)程中，首先合成自身的RNA 依賴(lài)性RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)結(jié)合到3'-UTR(Untranslated region，UTR)上，才能開(kāi)始病毒負(fù)鏈基因組的合成，隨后以負(fù)鏈基因組為模板，合成子代病毒的基因組[5-7]。已有研究表明，與經(jīng)典PRRSV 相比，HP-PRRSV 復(fù)制效率在非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞(Marc-145)和豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)中高出10～100倍左右[8]。

本研究對(duì)HP-PRRSV 和經(jīng)典PRRSV 進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)前者3'-UTR 中存在規(guī)律性的堿基缺失。但目前關(guān)于PRRSV 3'-UTR 的研究較少，該缺失對(duì)病毒復(fù)制的影響尚不可知。本研究基于HP-PRRSV HuN4 株感染性克隆，構(gòu)建突變體病毒，進(jìn)一步研究缺失堿基對(duì)PRRSV 復(fù)制的影響，為深入研究3'-UTR 在PRRSV 復(fù)制過(guò)程中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 HP-PRRSV HuN4 株感染性克隆pOK-HuN4 由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并保存；Marc-145 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。Q5 超保真DNA 聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶和T4 DNA 連接酶購(gòu)自NEB 公司；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent 購(gòu)自Roche 公司；PRRSV M 蛋白單克隆抗體(MAb)由田志軍研究員惠贈(zèng)；羊抗鼠IgG-FITC 購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司。膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自Invitrogen 公司。

1.2 PRRSV 3'-UTR 基因序列的比對(duì)分析 為了研究HP-PRRSV 和經(jīng)典PRRSV 在3'-UTR 序列上的差異，從NCBI 中下載了40 個(gè)PRRSV 3'-UTR 基因序列，其中HP-PRRSV 34 個(gè)，經(jīng)典PRRRSV 6 個(gè)，且病毒范圍廣，覆蓋我國(guó)18 個(gè)省份區(qū)域。利用DNAStar (Megalign)對(duì)40 個(gè)PRRSV 3'-UTR 基因序列進(jìn)行序列比對(duì)。

1.3 病毒RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)在線軟件Mfold 預(yù)測(cè)RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用服務(wù)器默認(rèn)參數(shù)：37 ℃，1 mol/L NaCl。通過(guò)預(yù)測(cè)得到CH-1、HuN4、HuN4-(17+G)和HuN4-△SL2 4 株病毒的3'-UTR 二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用RNAviz 2.0 軟件編輯上述二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)PRRSV HuN4 株基因組序列(EF635006)， 使用 Oligo 7 設(shè)計(jì) PRRSV 3'-UTR 區(qū)域的引物。引物由吉林庫(kù)美生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.5 突變質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 以pOK-HuN4 株感染性克隆質(zhì)粒為模板，采用(17+G)-F1/(17+G)-R1、(17+G)-F2/(17+G)-R2 為引物分別擴(kuò)增并命名為A、B 片段，△SL2-F1/△SL2-R1、△SL2-F2/△SL2-R2為引物分別擴(kuò)增并命名為C、D 片段(圖1)。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃30 s；98 ℃10 s、54 ℃30 s、72 ℃1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。經(jīng)電泳鑒定并膠回收A、B、C 和D 片段后，以A 和B 片段為模板，(17+G)-F1/(17+G)-R2 為引物進(jìn)行融合PCR，融合PCR 產(chǎn)物命名為AB 片段，反應(yīng)條件同上；以C和D 片段為模板，△SL2-F1/△SL2-R2 為引物進(jìn)行融合PCR，融合PCR 產(chǎn)物命名為CD 片段，反應(yīng)條件同上。電泳鑒定后分別膠回收AB 和CD 片段，以AscⅠ和MluⅠ雙酶切AB 和CD 片段，分別克隆至pOK-HuN4，構(gòu)建突變質(zhì)粒pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)，pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2。將親本質(zhì)粒pOKHuN4 以及突變質(zhì)粒pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2 分別以(17+G)-F1/(17+G)-R2、(17+G)-F1/(17+G)-R2、△SL2-F1/△SL2-R2 為引物進(jìn)行PCR 鑒定。同時(shí)將突變質(zhì)粒pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2 送于吉林庫(kù)美生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

圖1 突變體HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 的構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic representation of the construction of mutants HuN4-3'-UTR-17+G and HuN4-3'-UTR-△SL2

1.6 突變病毒的拯救及間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè) 將Marc-145 細(xì)胞均勻鋪于6 孔板中，待細(xì)胞形成80 %單層時(shí)，將質(zhì)粒pOK-HuN4、pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2 根據(jù)X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 試劑說(shuō)明分別轉(zhuǎn)染Marc-145 細(xì)胞，5 d 后收獲病毒，作為病毒P0 代，拯救病毒分別命名為HuN4、HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2。將P0 代病毒接種于匯合度為80 %的Marc-145 細(xì)胞中，72 h 后收獲病毒作為P1 代，以該方法直至獲取P3 代病毒液，分裝后凍于-80 ℃以備后用。將質(zhì)粒pOK-HuN4、pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2轉(zhuǎn)染Marc-145 細(xì)胞，5 d 后取下層細(xì)胞加入1 mL 無(wú)水乙醇室溫固定30 min，以PRRSV M 蛋白MAb(1∶100)為一抗，以山羊抗小鼠IgG-FITC (1∶100)為二抗，采用IFA 檢測(cè)各拯救病毒HuN4、HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2。

1.7 復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線 將親本病毒HuN4、突變體病毒HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 以MOI 0.01 接種于生長(zhǎng)至80 %單層Marc-145 細(xì)胞的6 孔板中，分別在轉(zhuǎn)染后0、24 h、48 h、72 h 和96 h收集病毒，分裝后-80 ℃保存。將不同病毒不同時(shí)間點(diǎn)的病毒接種于生長(zhǎng)至80 %單層Marc-145 細(xì)胞的96 孔板中，觀察并記錄細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)的孔數(shù)，參照Reed-Muench 法計(jì)算病毒TCID50值，以Graphpad 軟件繪制復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以上實(shí)驗(yàn)的3 次重復(fù)數(shù)據(jù)采用多重t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示，p＜0.05 表示差異顯著，p＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 P RRSV 3'-UTR 序列的變異分析結(jié)果 將34條HP-PRRSV 3'-UTR 和6 條經(jīng)典PRRSV 3'-UTR 基因以Megalign 進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果顯示，與經(jīng)典PRRSV 相比，HP-PRRSV 在3'-UTR 第17 位缺失G。其中34 株HP-PRRSV 均在3'-UTR 第17 位缺失G，表明該處缺失普遍存在于HP-PRRSV 中。

2.2 突變病毒二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 通過(guò)在線軟件Mfold 預(yù)測(cè)CH-1、HuN4、HuN4-(17+G)和HuN4-△SL2 病毒的3'-UTR 二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示HuN4 和CH-1 在二級(jí)結(jié)構(gòu)形成上有明顯差異；但HuN4-(17+G)、HuN4-△SL2 與HuN4- 在二級(jí)結(jié)構(gòu)形成上無(wú)差異(圖2)。表明HuN4 3'-UTR 中第17 位G 和第二個(gè)莖環(huán)SL2 的缺失并不改變HuN4 二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.3 突變質(zhì)粒的鑒定 將質(zhì)粒pOK-HuN4 以及突變質(zhì)粒pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOK-HuN4-3'-UTR-△SL2 以相應(yīng)引物PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段與預(yù)期片段大小一致，分別為647 bp、648 bp 和640 bp(圖3)，同時(shí)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與目的序列一致。表明正確構(gòu)建突變質(zhì)粒pOK-HuN4-3'-UTR-(17+G)和pOKHuN4-3'-UTR-△SL2。

圖3 突變質(zhì)粒HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 的PCR 鑒定Fig.3 Identification of mutated HuN4-3'-UTR-(17+G)and HuN4-3'-UTR-△SL2 plasmids by PCR

2.4 突變病毒拯救的IFA 檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)IFA 檢測(cè)病毒HuN4、HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2，結(jié)果顯示突變體病毒HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 均能夠被拯救，其中HuN4陽(yáng)性對(duì)照病毒也能夠被拯救，未加入質(zhì)粒的陰性對(duì)照不能夠被拯救(圖4)。表明HuN4 3'-UTR 中第17位堿基G 和第二個(gè)莖環(huán)SL2 的缺失不影響病毒的拯救，同時(shí)第二個(gè)莖環(huán)SL2 的缺失可以作為標(biāo)記疫苗的分子標(biāo)簽。

2.5 突變病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線 通過(guò)一步生長(zhǎng)曲線研究HuN4 3'-UTR 中第17 位堿基G 和SL2 的缺失對(duì)病毒復(fù)制的影響。復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線結(jié)果顯示，與親本病毒HuN4 相比，突變體病毒HuN4-3'-UTR-(17+G)病毒滴度較低，在感染后48 h 和96 h 二者差異顯著(p＜0.05)；同樣，與親本病毒HuN4 相比，突變體病毒HuN4-3'-UTR-△SL2 的滴度也有所降，且在感染后48 h、72 h 和96 h 二者差異極顯著(p＜0.01)(圖5)。表明HuN4 3'-UTR 中第17 位堿基G 的缺失促進(jìn)了HP-PRRSV 在Marc-145 細(xì)胞中的復(fù)制水平，但第二個(gè)莖環(huán)SL2 的缺失則降低HP-PRRSV 在Marc-145 細(xì)胞中的復(fù)制水平。

圖4 突變體病毒HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 的IFA 檢測(cè)Fig.4 Identification of mutated HuN4-3'-UTR-(17+G)and HuN4-3'-UTR-△SL2 viruses by IFA

3 討 論

HP-PRRSV 以致病性強(qiáng)、傳播迅速和死亡率高為特點(diǎn)，在我國(guó)流行范圍極廣，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)對(duì)HP-PRRSV 和經(jīng)典PRRSV 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，HP-PRRSV 基因組具有一些新的特征，其中最顯著的特點(diǎn)是相比于經(jīng)典PRRSV，HP-PRRSV 的NSP2 區(qū)域缺失了30 個(gè)氨基酸，但在感染性克隆的基礎(chǔ)上補(bǔ)平該缺失之后，顯示NSP2 區(qū)域的30 個(gè)氨基酸的缺失與HP-PRRSV 的復(fù)制無(wú)關(guān)[9]；研究還表明NSP9 和NSP10 共同決定HP-PRRSV 的致病性[10]。然而調(diào)控PRRSV 復(fù)制的關(guān)鍵基因需進(jìn)一步研究。

圖5 HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 突變病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 The growth curve of mutated HuN4-3'-UTR-(17+G)and HuN4-3'-UTR-△SL2 viruses

在PRRSV 感染細(xì)胞過(guò)程中，首先以其基因組為基礎(chǔ)，合成自身的RdRp，隨后結(jié)合到3'-UTR 上，以負(fù)鏈RNA 不連續(xù)轉(zhuǎn)錄模型開(kāi)始病毒負(fù)鏈RNA 的合成，隨后再以負(fù)鏈基因組為模板，啟動(dòng)亞基因組的轉(zhuǎn)錄和病毒基因組的復(fù)制。有研究證明PRRSV 3'-UTR 末端序列5'-AAUU-3' 和5'-AACCA-3' 對(duì)于維持病毒亞基因組合成和感染性至關(guān)重要[7]；PRRSV 3'-UTR 和ORF7 區(qū)域形成的“相吻結(jié)構(gòu)”是病毒復(fù)制的必要因素[11]；人工合成的干擾RNA 結(jié)合的3'-UTR 基因序列，可以有效抑制PRRSV 的復(fù)制，降低病毒基因滴度[12]。由此可見(jiàn)，3'-UTR 在PRRSV的復(fù)制過(guò)程中起到了非常關(guān)鍵的調(diào)控作用。但是目前對(duì)PRRSV 3'-UTR 的研究較少，也未能找到3'-UTR 中調(diào)控PRRSV 復(fù)制的關(guān)鍵基因，因此對(duì)PRRSV 3'-UTR 的研究變的尤為重要。

本研究基于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的HP-PRRSV HuN4株感染性克隆平臺(tái)，開(kāi)展了對(duì)HP-PRRSV 3'-UTR 區(qū)域的研究。首先HP-PRRSV 和經(jīng)典PRRSV 3'-UTR序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)HP-PRRSV 3'-UTR 中第17 位缺失堿基G，同時(shí)該處缺失普遍存在于HP-PRRSV 中。這與之前研究證明PRRSV 3'-UTR 中存在高度保守的一級(jí)序列結(jié)果一致[13]。隨后的突變質(zhì)粒構(gòu)建和病毒拯救實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HuN4-3'-UTR-(17+G)和HuN4-3'-UTR-△SL2 突變體病毒可以被拯救，且二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明HuN4 3'-UTR 第17 位堿基G 和第二個(gè)莖環(huán)SL2 的缺失并不改變HuN4 3'-UTR 二級(jí)結(jié)構(gòu)。最后的復(fù)制動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示與親本病毒HuN4比較，突變體病毒HuN4-3'-UTR-(17+G)呈現(xiàn)較低的病毒滴度，在感染細(xì)胞后48 h 和96 h 二者差異顯著(p＜0.05)。表明第17 位堿基G 的缺失增強(qiáng)了HP-PRRSV 的復(fù)制能力，這可能由于3'-UTR 第17位堿基的缺失改變了其對(duì)應(yīng)區(qū)域第二個(gè)莖環(huán)SL2 的堿基組成，進(jìn)而增加了復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(Replication and transcription complex，RTC)與3'-UTR 的結(jié)合水平，最終引起HP-PRRSV 復(fù)制能力的增強(qiáng)。有研究證明PRRSV 5'-UTR 中近5' 端莖環(huán)結(jié)構(gòu)影響病毒亞基因組的轉(zhuǎn)錄和病毒基因組的復(fù)制[14]。還有研究顯示Ⅱ型PRRSV APRRSV 株3'-UTR 末端部分堿基的改變會(huì)影響病毒的復(fù)制效率[7]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明HuN4 3'-UTR 中第二個(gè)莖環(huán)SL2 的缺失不影響病毒拯救，可以作為標(biāo)記疫苗的分子標(biāo)簽。

本研究初步揭示了我國(guó)HP-PRRSV 與經(jīng)典PRRSV 3'-UTR 在一級(jí)序列組成和二級(jí)空間結(jié)構(gòu)形成上的差異，明確了第17 位堿基G 的缺失可以增強(qiáng)HP-PRRSV 的復(fù)制能力。本研究為深入探究PRRSV 3'-UTR 的作用機(jī)制和功能奠定了基礎(chǔ)。