陽林江，汪銘書，程安春

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/ 預(yù)防獸醫(yī)研究所，四川成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/ 禽病防治研究中心，四川成都 611130；3.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都 611130)

皰疹病毒在自然界分布廣泛，可以感染兩棲類、禽類、哺乳類，也能感染靈長類和人類。多數(shù)皰疹病毒感染后可以引起機(jī)體不同程度的臨床癥狀和病理變化，如血管損傷、組織出血、消化道黏膜丘疹樣病變、淋巴器官和實質(zhì)器官的變性[1-2]；但也有感染后無臨床癥狀和病理變化的，如成年豬感染偽狂犬病毒為隱性感染[3]。皰疹病毒感染典型的流行病學(xué)特征是能夠建立潛伏感染，感染或康復(fù)者長期攜帶病毒。因感染的人或動物會成為無癥狀的攜帶者，其僅在子代病毒間歇性地通過出芽、胞吐或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而離開宿主細(xì)胞被釋放時才能檢測到，這使得皰疹病毒難以監(jiān)測和控制[4]。

根據(jù)病毒的理化性質(zhì)，皰疹病毒科可以分為α、β、γ 3 個亞科[5]。α 皰疹病毒主要包括人單純皰疹病毒1 型(Herpes simplex virus，HSV-1)、水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus， VZV)、 偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、馬皰疹病毒1 型(Equine herpesvirus 1，EHV-10 和鴨瘟病毒(Duck plague virus，DPV)等；β 皰疹病毒主要包括巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，如人CMV，即人皰疹病毒5 型(Human herpesvirus 5，HHV-5)等；γ 皰疹病毒如愛潑斯坦－巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，即人皰疹病毒4 型(Human herpesvirus 4，HHV-4)等。皰疹病毒體積較大、結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，基因組為雙鏈DNA，其基因編碼的蛋白中約有30 多種為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，分別凝聚形成核心、衣殼、皮層以及囊膜[6]。皮層填充于衣殼與囊膜間，但目前很多皮層蛋白的準(zhǔn)確功能還不是十分清楚[7-9]，其極有可能在病毒復(fù)制時具有雙重功能即參與病毒的初期感染和后期組裝，調(diào)控病毒的侵入、基因表達(dá)和免疫逃逸[10]。

UL11 基因編碼的皮層蛋白pUL11 對病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞、裝配、囊膜化、釋放等方面均具有重要作用。本文就UL11 基因及其編碼蛋白pUL11 的特點、結(jié)構(gòu)、定位以及相關(guān)功能等方面做一簡要綜述，以期為皰疹病毒及UL11基因的深入研究提供參考。

1 皰疹病毒UL11 基因及其編碼蛋白的特點

1.1 UL11 基因序列的特點 皰疹病毒的基因組由一獨特長區(qū)(UL)和一獨特短區(qū)(US)構(gòu)成，包繞于UL 和US 兩側(cè)的為反向重復(fù)序列。不同皰疹病毒的UL11 基因在基因組中的位置及基因大小有差異，如：HSV-1 UL11 基因的開放閱讀框(ORF)大小為288 bp[11]；EHV-1 UL11 由ORF51開放閱讀框編碼，大小為225 bp[12]；DPV 的UL11 基因位于基因組的100 220 bp～100 483 bp，全長為264 bp[13]；HCMV 的UL11 基因位于基因組的18 268 bp～19 119 bp，全長為852 bp[14]。大多數(shù)UL11 基因位于UL 區(qū)的UL10與UL12 之間，其編碼序列與UL12 基因的部分閱讀框重疊[15]；但也有不重疊的，如HHV-5 的UL11 基因不與UL12 重疊[14]。在所有高等脊椎動物皰疹病毒中均有UL11或同源基因，如EBV 中的BBLF1 即為UL11 的同源基因[16]。部分代表性皰疹病毒的UL11 ORF 在基因組中的定位及其與UL12 的關(guān)系見圖1。

1.2 UL11 基因編碼蛋白質(zhì)的特點 皰疹病毒UL11 基因的編碼蛋白pUL11 是一種小的外周結(jié)合膜蛋白。雖然不同皰疹病毒pUL11 的氨基酸序列同源性通常較低，但所有皰疹病毒pUL11 同系物的N 末端含有預(yù)測的N- 肉豆蔻?；盘栆约翱捎米髯貦磅；|(zhì)的一個或幾個連續(xù)的半胱氨酸殘基，pUL11 通過N- 末端肉豆蔻酸酯和鄰近的棕櫚酸酯部分結(jié)合宿主膜的細(xì)胞質(zhì)面或病毒囊膜的內(nèi)面[17]；C 端在不同皰疹病毒的功能尚未確定，Han 等的研究顯示，HSV-1 pUL11 的非保守C 末端具有與gE 的細(xì)胞質(zhì)尾結(jié)合的功能[18](圖2)。

圖1 部分代表性的皰疹病毒UL11 開放閱讀框及其與UL12 的關(guān)系

Leege 等的研究表明，HSV-1 pUL11 高爾基體靶向作用參與了蛋白質(zhì)的分類、包裝及輸出，“晚期”蛋白質(zhì)修飾，保證蛋白與脂質(zhì)的單向轉(zhuǎn)運，因此推測pUL11 可能與感染細(xì)胞的膜相關(guān)[19]。

皰疹病毒pUL11 含有與肉豆蔻酸和棕櫚酸兩種脂肪酸共價修飾的氨基酸基序，這種雙重修飾的蛋白質(zhì)通常能與抗去垢劑膜(Detergent-resistant membranes，DRMs)相結(jié)合，DRMs 是細(xì)胞膜中富含膽固醇和鞘脂的微區(qū)，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架組織和病原體進(jìn)入和退出等功能重要的“平臺”。Baird 等研究發(fā)現(xiàn)，HSV-1 pUL11 中亮氨酸- 異亮氨酸和酸性簇氨基酸基序控制pUL11 分子與DRMs 的結(jié)合[20](圖2)。pUL11 作為一種膜相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，需要用肉豆蔻酸酯和棕櫚酸酯進(jìn)行?；?，用于膜結(jié)合、脂笩運輸和病毒的積聚[21]。人類免疫缺陷病毒1 型(HIV-1)Gag需要通過肉豆蔻酰化來生產(chǎn)病毒，因此推測UL11 的酰化對于皰疹病毒有效的病毒粒子生產(chǎn)是必需的。

Western blot 檢測表明，傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)在感染雞胚腎細(xì)胞(CEK)后3 h、6 h 和9 h 檢測到低水平的pUL11，說明pUL11在病毒感染的晚期才表達(dá)[22]。

圖2 UL11 結(jié)構(gòu)域簡圖及其與抗去垢劑膜的關(guān)系

1.2.1 UL11 基因編碼蛋白在感染細(xì)胞中的定位皰疹病毒UL11 基因編碼蛋白在感染細(xì)胞中定位于細(xì)胞的各種膜結(jié)構(gòu)中，如細(xì)胞膜、胞漿中含膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器。Kopp 等通過免疫熒光試驗和共聚焦激光掃描發(fā)現(xiàn)，在PRV 感染的兔腎細(xì)胞(RK13)中，pUL11 特異性熒光主要在細(xì)胞質(zhì)的高爾基體以及細(xì)胞膜中，但不具通透性的細(xì)胞上未檢測到pUL11 特異性熒光，表明pUL11 定位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面[17]；Yeh-PC 等研究表明，HSV-1 感染細(xì)胞后，pUL11 錨定在細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)[23]；Badr 等將EHV-1 Ab4p 株感染胎馬腎細(xì)胞(FHK-Tcl3.1)和RK13 細(xì)胞，通過間接免疫熒光(IFA)發(fā)現(xiàn)，pUL11 主要集中在[12]高爾基體；在β 皰疹病毒中，Gabaev 等將表達(dá)人CMV UL11 的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)pUL11 暴露在細(xì)胞膜上[21]；在γ 皰疹病毒中， Chiu 等將EBV BBLF1-Flag 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A7 細(xì)胞，通過IFA 發(fā)現(xiàn)BBLF1 定位在反面高爾基體區(qū)域[16]。

1.2.2 pUL11 在病毒粒子中的定位為了確定pUL11 是否是病毒粒子的組份及其在病毒顆粒中的定位，Kopp 等用兔抗pUL11 對純化的PRV 粒子進(jìn)行膠體金免疫染色，通過電子顯微鏡觀察到膠體金標(biāo)記的pUL11 緊鄰囊膜，表明PRV 的pUL11 是膜相關(guān)的蛋白質(zhì)[17]；PRV 感染的RK13 超薄切片中，特異性pUL11 血清可以標(biāo)記胞質(zhì)內(nèi)具有囊膜的病毒粒子和可能為高爾基體衍生的胞內(nèi)膜以及細(xì)胞外病毒顆粒，而核周膜和核膜中的初級包膜病毒顆粒沒有特定的金顆粒標(biāo)記，表明UL11 定位在出核后的病毒粒子中。

2 UL11 基因編碼蛋白質(zhì)的功能

皰疹病毒UL11 基因編碼的蛋白會影響病毒復(fù)制。Schimmer 等在RK13 細(xì)胞中研究UL11 基因?qū)? 型馬皰疹病毒(Equine herpesvirus 1，EHV-1)分離株和疫苗株在細(xì)胞中的一步生長動力學(xué)的影響，結(jié)果缺失UL11 基因后可引起細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外病毒滴度降低約10 至20 倍[24]。Kopp研究UL11 基因缺失對PRV 在RK13 細(xì)胞中的一步生長動力學(xué)的影響，結(jié)果顯示，與親本病毒株相比，UL11 缺失株的病毒滴度降低了10 倍，非必需包膜糖蛋白M 缺失株的病毒滴度降低了50 倍[25]；UL11/gM 雙缺失株與gM 缺失株、UL11 缺失株相比，病毒滴度降低了大約100 倍。表明，gM 與UL11 同時缺后會對病毒粒子的復(fù)制產(chǎn)生顯著影響。Kim 等研究也發(fā)現(xiàn)，僅在同時刪除UL11 和編碼gM 的UL10 基因后才觀察到HSV-1 的復(fù)制缺陷，表明兩種蛋白質(zhì)可能有助于病毒粒子的復(fù)制[26]。Walter 等研究發(fā)現(xiàn)，缺失UL11 的ILTV 感染CEK，形成的空斑大小較野毒株縮小了58 %，而回補(bǔ)株表現(xiàn)出與野毒株一致的空斑大小；缺失株的最大病毒滴度比野毒株降低了10 倍[22]。這些研究表明，多數(shù)皰疹病毒的pUL11 雖然對病毒在細(xì)胞中的復(fù)制不是必需的，卻可以影響病毒復(fù)制。而Badr等構(gòu)建了缺失UL11 和UL11 C 端截斷的EHV-1 感染性克隆，結(jié)果顯示將UL11 缺失和截短的BAC DNAs 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后不產(chǎn)生子代病毒，而回復(fù)UL11 后轉(zhuǎn)染細(xì)胞則可以產(chǎn)生病毒，表明EHV-1 的UL11 對病毒復(fù)制是必需的[12]。UL11 基因編碼蛋白對病毒復(fù)制周期的影響具體體現(xiàn)在進(jìn)入宿主細(xì)胞、囊膜化、釋放等方面。

2.1 誘導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜融合 Kim 等研究了UL11對HSV-1 進(jìn)入細(xì)胞的影響，缺失gM 或UL11 的病毒株與野毒株相比形成相同的空斑形成單位所需的時間更長，表明gM 或UL11 缺失使病毒進(jìn)入細(xì)胞的速度變慢，且嚴(yán)重抑制病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合[26]；Han 等用缺失了UL11 的HSV-1 感染HaCa T 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與野毒株相比缺失病毒在細(xì)胞上產(chǎn)生的空斑變小[27]。Schimmer 等用缺失UL11 的病毒株EHV-1 感染RK13 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)UL11 的缺失對空斑形態(tài)影響顯著，最大空斑的平均直徑分別降低到親本病毒空斑的23.2 %或34.7 %，并且對缺失株形成合胞體的能力有影響[24]。這些研究表明pUL11 與病毒的侵入及病毒在細(xì)胞與細(xì)胞之間的擴(kuò)散有關(guān)。

2.2 參與病毒粒子初級包膜的形成和次級囊膜化過程對HSV-1、 ILTV、 PRV 和鼠巨細(xì)胞病毒(Murine cytomegalovirus，MCMV)的研究均表明，UL11 在病毒粒子的次級囊膜化過程中具有重要作用，pUL11 的缺失將導(dǎo)致病毒粒子在細(xì)胞質(zhì)中次級包膜的缺損[22,25,28-29]。Leege 等在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HSV-1 的UL11 缺失株與親本株相比，其發(fā)生次級囊膜化缺陷，表現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中存在裸露核衣殼；在感染HSV-1 的gM/UL11 雙缺失突變株的RK13 細(xì)胞中，形成大量由與電子致密物質(zhì)皮層結(jié)合的核衣殼組成的胞質(zhì)內(nèi)包涵體[19]。Kopp 等用PRV UL11 缺失株感染RK13，電子顯微鏡觀察到感染細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)正常，在核膜的內(nèi)層沒有明顯的衣殼積聚且細(xì)胞核未受任何損傷，然而胞質(zhì)內(nèi)膜(特別是高爾基體附近或高分子膜)扭曲，膜聚集彎曲并且緊密連接，推測pUL11 可能會妨礙蛋白質(zhì)核衣殼到次級囊膜化位點的進(jìn)程[17]。

Fulmer 等研究中，還觀察到UL11 的缺失會抑制細(xì)胞核中病毒核衣殼初級包膜的形成從而引起衣殼在細(xì)胞核內(nèi)的積聚，并且UL11 缺失的病毒粒子形成具有彌漫性的衣殼的聚集體，表明UL11 對病毒粒子的初級囊膜化也具有重要的作用[30]。

2.3 影響病毒粒子的釋放 UL11 基因?qū)Σ《玖Ｗ拥某鲅坑幸欢ǖ挠绊?。Baines 等的研究表明，缺失61 % UL11 基因的HSV-1 突變病毒與野生型病毒相比，從Vero 細(xì)胞中釋放到細(xì)胞外的感染性病毒的量降低了1 000 倍以上；缺失61 % UL11 基因的突變病毒釋放到細(xì)胞外的過程顯著延遲，在感染后20 h～26 h 細(xì)胞外的感染性病毒顆粒只增加15 倍，而野生型病毒在感染后8 h～14 h 細(xì)胞外病毒卻增加500 倍[31]；Chouljenko 等構(gòu)建了HSV-1 的UL11缺失株，采用Q-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，感染細(xì)胞上清中病毒粒子比細(xì)胞中病毒粒子少[32]。

3 pUL11 與病毒其它蛋白以及宿主相關(guān)蛋白的相互作用

3.1 pUL11 與pUL16 和pUL21 的相互作用 pUL11 可與多種蛋白相互作用，其中與pUL16、pUL21 之間的相互作用受到了廣泛的關(guān)注。Yeh 對HSV-1 pUL11 和pUL16 皮層蛋白相互作用進(jìn)行研究，認(rèn)為pUL11 和pUL16 之間的相互作用是直接的，并且研究表明兩種蛋白間的結(jié)合需要pUL16 內(nèi)幾種保守的半胱氨酸[23]。

Chadha 等通過共轉(zhuǎn)染表達(dá)pUL11 和pUL16，觀察到二者的共定位；然后將大腸桿菌表達(dá)的含His 標(biāo)簽的UL16 蛋白與含pUL11 的GST 和不含pUL11 的GST 混合孵育后進(jìn)行Pull down 試驗，用His 標(biāo)簽抗體對pUL16 進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果GST-pUL11 能顯出pUL16 條帶，而GST 卻不能[33]。PRV 的GST-pUL11 能下拉pUL16 和pUL21，但GST-pUL11 不能下拉缺失了UL16 基因病毒的pUL21[34]，表明pUL11 與pUL16 具有直接相互作用，但只有在pUL16 存在的情況下，pUL11、pUL16 和pUL21 才能結(jié)合在一起，pUL11 與pUL21 不存在直接相互作用。

Han 等將UL11、UL16 和gE 真核表達(dá)質(zhì)粒分別兩兩共轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)UL16 與gE 的相互作用很弱，但pUL11 能募集pUL16 而促進(jìn)pUL16 與gE 在核周位置共定位[28]。

3.2 UL11 與gE 相互作用 Kopp 等最先報道pUL11 可以與gE 結(jié)合[17]。pUL11 能特異性結(jié)合到gE 胞內(nèi)域(CT)。Farnsworth 采用免疫沉淀方法檢測量化分析后，發(fā)現(xiàn)結(jié)合到全長gE 的pUL11 與缺失了gE CT 結(jié)構(gòu)域的gE- 突變株相比，大約多了5 倍；與缺少大部分CT 結(jié)構(gòu)域的突變株相比，大約多了2 倍；只表達(dá)gE 495 位之后氨基酸和519 位之后氨基酸的兩個突變株免疫共沉淀結(jié)果為全長gE 的83.6 %，表明pUL11 特異性結(jié)合gE 主要涉及gE CT 結(jié)構(gòu)域C 末端附近的495～550 位氨基酸殘基[35]。Han等分別缺失UL11 和gE 尾端后，對感染細(xì)胞的病毒粒子進(jìn)行純化，免疫印跡檢測顯示，在缺失gE 尾端的情況下，參與病毒粒子裝配的pUL11 的量降低[28]；同樣，在缺失UL11 的情況下，參與病毒粒子裝配的gE 的量也下降[17]。

3.3 pUL11 與pUL16、pUL21 和gE 的相互作用 pUL11-pUL16-pUL21 復(fù)合體通過pUL11 和pUL16 組裝在gE 的細(xì)胞質(zhì)尾部上與膜相互作用，pUL11 與gE 直接結(jié)合促進(jìn)gE-pUL16 相互作用。pUL11-pUL16-pUL21 復(fù)合物對gE 在感染細(xì)胞膜上的積累很重要，gE 可促進(jìn)病毒感染細(xì)胞合胞體的形成和病毒在細(xì)胞之間的傳播，缺失UL11、UL16和UL21 后的HSV-1 感染Vero 細(xì)胞后，gE 在細(xì)胞表面的積累大幅度降低[27]。

Han 等研究了pUL11、pUL16、pUL21 和gE 的共定位，單獨轉(zhuǎn)染表達(dá)時，pUL16 和pUL21 分布在整個細(xì)胞中但主要在胞核；gE 分布在核膜和細(xì)胞質(zhì)中類似于高爾基體腔和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)域的斑點區(qū)；而pUL11 如預(yù)期在反面高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(Trans-golgi network，TGN)中分布。當(dāng)4 者共同表達(dá)時，它們發(fā)生了共定位：pUL16 和pUL21的定位發(fā)生了改變，由原來的細(xì)胞核定位轉(zhuǎn)移到核周位置；gE 的定位也發(fā)生了改變，從核膜轉(zhuǎn)移并與其它3 種蛋白質(zhì)在相同的核周位置積聚[27]。

綜上可知，UL11 與gE、UL16 和UL21 均存在較強(qiáng)的結(jié)合能力，但UL16 與gE 結(jié)合能力較弱；UL11 與UL21不存在直接的相互作用，但可與UL16 結(jié)合間接與UL11發(fā)生相互作用，且UL21 可以促進(jìn)UL11 與UL16 的相互作用；UL11 可以促進(jìn)gE 與ULL16 的結(jié)合(圖3)。

圖3 pUL11 的定位及其與其他蛋白的相互作用

3.4 pUL11 與CD45 的相互作用與免疫逃逸 受體型酪氨酸磷酸酶CD45 在淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟、功能調(diào)節(jié)及信號傳遞中具有重要意義，在T 細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有中心作用。Gabaev 等通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，HCMV 膜結(jié)合的pUL11 以及可溶性pUL11-Fc 蛋白均可以與CD45 相互作用，當(dāng)T 細(xì)胞與較高濃度的可溶性UL11-Fc (人IgG 的Fc 區(qū)域與pUL11 C 末端胞外域融合)融合蛋白孵育后，再用TCR 特異性抗體刺激，T 細(xì)胞的增殖減弱。該結(jié)果表明，pUL11 可能降低CD45 的活性而抑制T 細(xì)胞效應(yīng)子功能，有助于保護(hù)感染細(xì)胞免受HCMV 特異性T 細(xì)胞的侵害[21]?？梢?，pUL11 具有免疫抑制特性，通過抑制CD45 破壞T 細(xì)胞功能是HCMV 的一種免疫調(diào)節(jié)策略。

3.5 pUL11 與CD8 T 細(xì)胞 Gabaev 將野生HCMV 及其UL11 缺失病毒分別感染人胚肺成纖維細(xì)胞后，再與HCMV 立即早期蛋白IE1 和被膜蛋白pp65 抗原特異性的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTLs)共同培養(yǎng)，結(jié)果檢測到野生HCMV 及其UL11 缺失病毒組IE1和pp65 蛋白的表達(dá)量、人白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)以及IFN-γ 的表達(dá)水平相似；進(jìn)一步用慢病毒載體在HEK293T 細(xì)胞中高水平表達(dá)pUL11 后，用ELISA 的方法檢測干擾素產(chǎn)生量，結(jié)果IFN-γ 水平與對照組也無差異，表明pUL11 不影響CD8 T 細(xì)胞活性[36]。

4 展 望

目前，皰疹病毒UL11 基因及其功能的研究大都是針對人源皰疹病毒的，動物皰疹病毒的研究較少，對多種皰疹病毒UL11 基因的研究將有利于全面闡明UL11 基因的功能和作用。UL11 基因雖然小，但對于病毒粒子復(fù)制和裝配具有重要意義，因此進(jìn)一步開展UL11 基因及其編碼蛋白與病毒DNA 的復(fù)制相關(guān)的出芽、包裝、囊膜化、釋放等機(jī)制的研究，不僅可為闡述病毒復(fù)制的生命周期提供參考，也有利于了解皰疹病毒致病機(jī)理。此外，大多數(shù)皮層蛋白均具有免疫逃逸的功能[37-39]，UL11 也編碼一種皮層蛋白，且與其發(fā)生相互作用的pUL16 和gE 也具有逃逸功能[40-41]，但UL11 與免疫逃逸的關(guān)系報道較少，因此有必要進(jìn)一步明確其在病毒免疫逃逸中的作用及其作用機(jī)制。