潘昱婷，賈仁勇,3*

(1.四川農業(yè)大學禽病防治研究中心，四川成都611130；2.四川農業(yè)大學預防獸醫(yī)研究所，四川成都611130；3.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都611130)

糖基化是蛋白質一種重要的翻譯后修飾調控機制。在真核細胞中，糖基化的合成主要包括：N糖基化、O 糖基化及糖基磷脂酰肌醇錨3 種途徑。新生肽鏈合成時或合成后，糖鏈與肽鏈中特定序列(Asn-X-Thr/Ser，其中X 為除脯氨酸外的任意氨基酸)的天冬酰胺(N)相連接，所以將該糖基化類型稱為N 連接糖鏈，又稱N糖基化[1]。在真核細胞中，N糖基化的合成在內質網(wǎng)和高爾基體中完成，糖蛋白中N 連接聚糖在內質網(wǎng)中將預先生成的寡糖轉運至新生肽鏈的天冬酰胺殘基中，再將其轉移至高爾基體內進一步修飾，并在高爾基體糖苷酶和糖基轉移酶的作用下，生成3 種類型的N 連接糖鏈：高甘露糖型(High mannose type)、雜合型(Hybrid type)及復合型(Complex type)(圖1)。

圖1 N- 糖基化的合成途徑

黃病毒(Flavivirus)是主要由節(jié)肢動物傳播的一類單股正鏈RNA 病毒[1]，其基因組編碼3 種結構蛋白：衣殼蛋白(Capsid protein，C)、膜蛋白前體/ 膜蛋白(Precursor membrane/Membrane protein，prM/M)和包膜蛋白(Envelope protein，E)，其中包膜蛋白(即E蛋白)是病毒侵染過程中的關鍵蛋白，它能夠被細胞表面受體識別，介導病毒的吸附與侵入，并參與病毒同質膜的融合[2]。黃病毒E蛋白大多數(shù)屬于糖蛋白，含一個或多個潛在的N糖基化位點，位點的數(shù)量和位置也存在差異，如蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus， TBEV)[3]、 登革熱病毒(Dengue virus，DENV)[4]、西尼羅河病毒(West Nile virus，WNV)[5]、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)[6]、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)[7]和坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)[8]等，在E蛋白aa153～aa156 位殘基處存在潛在的N糖基。

1 黃病毒E蛋白N糖基化的功能

E蛋白是黃病毒生命周期中的重要物質，其N糖基化在病毒復制、增殖、釋放等過程中發(fā)揮重要作用(表1)。

1.1 E蛋白N糖基化影響黃病毒的復制 E蛋白N糖基化對黃病毒在哺乳動物和蚊子細胞系中進行有效復制是非常必要的。研究表明DENV (16681 株)E蛋白aa67 處N糖基化位點缺失后嚴重影響病毒復制，使其無法產(chǎn)生新的感染性病毒，并嚴重影響其在哺乳動物細胞中的增殖；而aa153 處N糖基化位點缺陷的突變病毒仍然可以在哺乳動物細胞中復制，表明DENV E蛋白aa153 處N糖基化位點對病毒復制是非必需的，而aa67 處N糖基化位點對DENV 在哺乳動物細胞中的復制和增殖是必需的[10]。當WNV E蛋白N糖基化缺失后，病毒組裝能力變弱，蛋白折疊效率顯著降低，表明N糖基化在促進病毒蛋白折疊中發(fā)揮重要作用[17]。Zai 等將JEV (P3 株)E蛋白N糖基化的突變株與野生型病毒相比較，結果顯示JEV E蛋白N糖基化的缺失同樣降低了E蛋白的折疊效率[14]。

此外，研究者發(fā)現(xiàn)抑制E蛋白N糖基化的形成還將導致E蛋白分泌量顯著降低，這意味著E蛋白N糖基化嚴重影響黃病毒感染細胞后的釋放量[18]。在研究WNV E蛋白N糖基化時發(fā)現(xiàn)，其N糖基化有利于E蛋白更快速分泌[17]。Goto 等比較分析了TBEV (Oshima5 株，GenBank登錄號：AB062003)E蛋白在N糖基化缺失和未缺失的情況下導致E蛋白分泌水平、生物學特性等的變化，結果顯示，在E蛋白N糖基化缺陷的突變株中，E蛋白的分泌量降低至野生型病毒E蛋白分泌量的10 %，且當E蛋白aa66 和aa153 處均具有N糖基化位點時，其分泌的E蛋白水平比野生型病毒分泌的蛋白水平高出4 倍[9]。對ZIKV 的研究也發(fā)現(xiàn)，E蛋白N糖基化對E蛋白的分泌也有相似影響，Mossenta 等揭示了ZIKV (MR766 株，Gen-Bank 登錄號：AEN75266.1)E蛋白N糖基化的缺失導致ZIKV E蛋白的分泌受損，推測缺失N糖基化的修飾致使E蛋白折疊受損進而影響該蛋白的分泌[15]。這些數(shù)據(jù)均充分表明N糖基化在黃病毒E蛋白分泌過程中發(fā)揮著重要作用。

表1 黃病毒E蛋白N糖基化位點Table 1 N-glycosylation of the E protein in flaviviruses

1.2 E蛋白N糖基化影響黃病毒的感染性 黃病毒E蛋白N糖基化與病毒的感染性也密切相關，其中DENV 較為典型。DENV E蛋白中具有兩個潛在的N糖基化位點，Mondotte 等發(fā)現(xiàn)DENV E蛋白中的兩處N糖基化功能有所差異，將E蛋白aa153 處N糖基化位點敲除后，DENV的感染性明顯降低；而敲除E蛋白aa67 處的N糖基化位點后，DENV 仍然可以感染哺乳動物細胞并進行復制和翻譯，但沒有產(chǎn)生新的感染性病毒顆粒，結果顯示該病毒E蛋白aa153 處N糖基化修飾與病毒的感染性密切相關[19]。而TBEV (Oshima5 株)E蛋白N糖基化的缺陷則可以影響病毒粒子的折疊及其穩(wěn)定性，盡管E蛋白的總體水平保持不變，但由于E蛋白缺乏N糖基化修飾，導致病毒顆粒的感染性降低[20]。類似現(xiàn)象在ZIKV 中也存在，即E蛋白N糖基化缺失后使ZIKV 對哺乳動物細胞的感染性降低[15]。與此相反，Hanna 等在研究WNV 時得出了與之不同的結果，他們將哺乳動物、禽類和蚊子細胞分別感染Ⅰ型、Ⅱ型WNV 和敲除了E蛋白N糖基化位點的Ⅱ型WNV，結果顯示E蛋白N糖基化的敲除增強了病毒的感染性，且該現(xiàn)象在蚊子細胞中尤為顯著[17]，不同黃病毒E蛋白N糖基化功能試驗結果存在差異。因此，E蛋白N糖基化對病毒感染力的作用機制有待進一步深入探究。

1.3 E蛋白N糖基化影響黃病毒的毒力 E蛋白作為黃病毒的主要抗原，與病毒的致病性密切相關。研究表明，WNV E蛋白N糖基化對病毒的致病性和病毒對小鼠的神經(jīng)侵襲力均具有重要作用[12]。據(jù)報道，近期歐洲與北美洲暴發(fā)的WNV 病是由毒力較強的病毒所致，而一些早期流行的WNV 分離株則毒力較低。隨后有研究顯示引起近期大規(guī)模疾病暴發(fā)的WNV (PaH651 株，GenBank 登錄號：AF001560；Heg101 株，GenBank 登錄號：AF001568)在其E蛋白中均具有N糖基化位點，而早期毒力較低的流行WNV 分離株(ArD78016 株，GenBank 登錄號：AF001556；EntM63134 株，GenBank 登錄號：AF001573)E蛋白中則無N糖基化位點[13]。Beasley 等將WNV 強毒株與弱毒株進行比較，分析其E蛋白中氨基酸序列，顯示強毒株E蛋白氨基酸序列中具有導致N糖基化基序喪失的差異氨基酸，為了確定增強WNV 神經(jīng)侵襲力的分子決定簇，采取定點敲除了WNV (NY99 株，GenBank 登錄號：AF196835)的N糖基化位點后，發(fā)現(xiàn)該突變病毒株神經(jīng)侵襲力衰減到與弱毒野生型病毒相當?shù)乃剑瑥亩C實了E蛋白N糖基化具有影響WNV 毒力的能力，該結論同Khaled 等試驗結果一致[21]。此外，也有研究顯示TBEV (16681 株)E蛋白中N糖基化的缺失，可以降低病毒在猿猴與蚊子細胞中的病毒滴度，并且觀察到病毒缺失株對小鼠的神經(jīng)毒力也顯著降低[10]。

1.4 E蛋白N糖基化是影響DC-SIGN 與病毒互作的關鍵部位 樹突狀細胞- 特異性細胞間黏附分子-3 捕獲非整合素(Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integri，DC-SIGN)為鈣依賴性C 型凝集素家族的成員，在病毒與樹突狀細胞相互作用之間起著重要作用[22]。該凝集素DC-SIGN 受體對不同病原體中的N糖基化均具有親和力，也是DENV 和WNV 的主要細胞受體[23]。研究顯示：DC-SIGN 與DENV 之間的相互作用發(fā)生在E蛋白的N糖基化處[24]，Navarro 等證實了DENV 可以通過E蛋白N糖基化與DC-SIGN 相互作用影響病毒的感染性，在E蛋白aa67 和aa153 殘基處具有N糖基化位點的DENV 比僅在E蛋白aa67 處含N糖基化位點的DNEV 能夠更加有效地與DC-SIGN 相互作用[11]。研究ZIKV 結果發(fā)現(xiàn)，E蛋白N糖基化可以通過與DC-SIGN 結合抑制下游免疫信號傳導途徑從而加速ZIKV 對機體的侵襲[25]。

2 黃病毒N糖基化的應用

E蛋白N糖基化不但可以維持抗原構象，屏蔽潛在的中和表位，而且還與病毒的感染性及毒力緊密相關，因此，可以利用N糖基化修飾研發(fā)新型黃病毒疫苗。Roby等制備了針對E蛋白aa154 處缺失N糖基化的昆津病毒(KUNV)疫苗，得到了較為理想的結果[26]。有學者構建了含野生型JEVprME基因和突變型JEVprME基因的核酸疫苗，結果顯示：采用prME蛋白aa154 處N糖基化缺失的核酸疫苗免疫的小鼠能夠完全抵抗JEV 的攻擊，佐證了prME蛋白aa154 處N糖基化位點的缺失顯著增強了該核酸疫苗的免疫原性，隨后開展了該核酸疫苗對豬的免疫保護性的深入探究[27]。也有學者使用反向疫苗學方法，從黃病毒基因組中篩選出具有N糖基化的抗原基因作為候選疫苗，對該抗原基因進行高通量克隆、蛋白表達，再對純化后的抗原進行體內外評價以期獲得能夠抵抗病毒的疫苗[28]。這些研究均表明了黃病毒E蛋白N糖基化對黃病毒新型疫苗的研發(fā)有著重要作用，但具體如何應用N糖基化對E蛋白的影響來研制相關疫苗尚待探究。

有研究顯示在DENV 嚴重感染時，使用α- 糖苷酶類藥物可以抑制DENV 的復制，從而減少患者體內的病毒載量，達到控制病情及防止病情惡化的作用，其機制主要是通過藥物抑制機體糖基化酶，從而抑制病毒蛋白糖基化，進而抑制病毒的復制[29]。葡萄糖苷酶抑制劑也可以用于抗病毒，該抑制劑可以阻礙病毒蛋白質的糖基化過程，并降低病毒與CD4+T 細胞的結合能力，在抗病毒藥物研發(fā)方面有著廣泛的前景[30]。有研究指出具有N糖基化的DENV 感染可以被某些碳水化合物結合劑(Carbohydratebinding agents，CBAs)有效阻斷，該CBAs 可以通過與DENV E蛋白N糖基化的結合，阻礙DC-SIGN 介導的病毒向T 淋巴細胞傳播而直接抑制病毒感染，起到抗病毒效果[31]。更有通過針對抗體藥物N糖基化結構進行糖工程改造制備糖鏈優(yōu)化的抗體藥物，該藥物可以進一步提高抗體藥物療效，并優(yōu)化藥物穩(wěn)定性，這是單克隆抗體藥物的研發(fā)新思路。

3 展 望

近年來關于黃病毒E蛋白N糖基化對病毒生命周期影響的研究越來越多，黃病毒依賴E蛋白N糖基化實現(xiàn)病毒侵入宿主細胞、病毒復制和病毒釋放等功能，還與病毒毒力、感染性密切相關。雖然已經(jīng)對黃病毒E蛋白N糖基化進行了大量的探究，其理論已被逐步應用于抗病毒新型疫苗及相關藥物的研發(fā)，但黃病毒E蛋白N糖基化的功能及其作用機制尚不十分清晰，藥物研發(fā)與應用尚需深入研究。