□ 馬曉娟 謝有發(fā) 余銀芳 李詒光（通訊作者） 江中藥業(yè)股份有限公司

枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源性中藥藥材，性甘味平，滋補(bǔ)肝腎、益精明目[1]。枸杞原漿經(jīng)乳酸菌發(fā)酵不僅會(huì)產(chǎn)生豐富愉悅的風(fēng)味而讓消費(fèi)者更易接受，同時(shí)乳酸發(fā)酵帶來的益生作用也提高了枸杞的藥用保健價(jià)值，為枸杞類飲品市場(chǎng)擴(kuò)展了更大的開發(fā)空間。

枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP）是一種水溶性蛋白多糖，其作為枸杞的重要活性成分，主要有提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等生理作用[2-4]。中藥材中的一些多糖類物質(zhì)還具有一定的益生元功能——能夠促進(jìn)乳酸菌在腸道內(nèi)的增殖[5-7]，最終達(dá)到調(diào)節(jié)腸道菌群、減少腸道疾病發(fā)生的效果。目前，關(guān)于酵母發(fā)酵枸杞酒或乳酸發(fā)酵枸杞果蔬飲品的工藝報(bào)道較多，如楊梅枸杞酒[8]、枸杞藍(lán)莓酒[9]、石榴枸杞酒[10]等，陳萬更用乳酸菌發(fā)酵了枸杞綠茶[11]，徐婧君等用植物乳桿菌發(fā)酵果蔬奶（枸杞與胡蘿卜）[12]。但是，單純以枸杞進(jìn)行乳酸發(fā)酵的案例相對(duì)較少，且主要以工藝研究為主。許亮等[13]考察了枸杞果酒發(fā)酵過程中多糖先增大、后減小的變化規(guī)律，并最終維持在最低水平。本研究以發(fā)酵40h的枸杞原漿為檢測(cè)樣品，對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間的原漿進(jìn)行枸杞多糖和活菌數(shù)的測(cè)定，考察枸杞多糖和活菌數(shù)在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律，以期為枸杞原漿的乳酸發(fā)酵機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞（市售寧夏中寧枸杞）；植物乳桿菌360（Lactobacillus plantarum），四川高福記生物科技有限公司；無水葡萄糖（食品級(jí)原料），山東保齡寶生物股份有限公司；D-無水葡萄糖（標(biāo)準(zhǔn)品），中國(guó)藥品生物制品檢定所；硫酸、苯酚、95%乙醇、NaCl、MRS固體培養(yǎng)基成分等試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HM-928料理機(jī)，廣州黑馬電器有限公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；TD5M臺(tái)式低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)，SHIMADZU CORPORATION；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái)，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；恒溫生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；320 pH Meter，METTLER TOLEDO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵工藝

1.3.1.1工藝流程

干枸杞→料液比1:6→浸提→打漿（添加5%葡萄糖）→滅菌（105℃、15min）→冷卻、接種（萬分之八）→發(fā)酵（37℃、40h）→成品→去籽、調(diào)配飲料。

1.3.1.2 工藝要點(diǎn)

原料處理：挑取顆粒均勻、飽滿的枸杞干果，用水沖洗兩次以去除表面的雜質(zhì)、灰塵等。

浸泡：以料水比1:6的比例，用溫水（40～50 ℃）浸泡枸杞至變軟。

打漿：將浸泡后的枸杞料液加入5%葡萄糖一起進(jìn)行打漿、破碎。

滅菌：在105℃下滅菌15min，滅菌時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)破壞枸杞的色澤。

冷卻：采用自來水及時(shí)分段冷卻。

接種：采用植物乳桿菌菌劑進(jìn)行直投式接種，接種量為原漿重量的萬分之八，將稱好的菌劑溶于少量無菌水后投入原漿中。

發(fā)酵：在37℃下發(fā)酵40h，定期取樣。

1.3.2 pH值測(cè)定

采用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，每隔4h取樣。

1.3.3 多糖測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[1，14]進(jìn)行測(cè)定，每隔8h取樣。

1.3.3.1 對(duì)照品制備

葡萄糖（0.1mg/mL）：準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25mg，溶解后置于250mL容量瓶中定容。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0mL至具塞試管，分別加水定容至2.0mL，然后加1mL5%苯酚溶液，搖勻后加入5mL濃硫酸（H2SO4）搖勻，靜置10min。將具塞試管放入水浴鍋（40℃）保溫15min，迅速冷卻至室溫，放置20min后在490nm下進(jìn)行紫外吸光度的測(cè)定。

1.3.3.3 供試樣品制備

取50mL發(fā)酵前后的原漿離心，取上清液3mL，加入30mL95%乙醇，醇沉20min后離心，4000r/min離心20min；棄去上清液，用85%乙醇進(jìn)行洗滌，最后加水定容至25mL；取200μL樣品測(cè)定吸光度。

1.3.3.4 樣品多糖測(cè)定

取200 μL樣品溶液至具塞試管，分別加水定容至2.0mL，加5%苯酚溶液1mL，搖勻后加入濃硫酸（H2SO4）5mL再次搖勻，靜置10min；將具塞試管放入水浴鍋（40℃）保溫15min，迅速冷卻至室溫，放置20min；在490nm下進(jìn)行紫外吸光度的測(cè)定。

1.3.4 活菌數(shù)測(cè)定

采用平板（MRS固體培養(yǎng)基）稀釋法[15]，每隔4h取樣。

1.3.4.1 樣品處理

取發(fā)酵枸杞原漿1mL，加入至9mL無菌生理鹽水中，稀釋度為10-1樣液，按此方法依次將枸杞原漿稀釋到10-6、10-7樣液備用。

1.3.4.2乳酸菌計(jì)數(shù)

取稀釋度為10-6、10-7發(fā)酵枸杞原漿1000μL菌液涂布MRS固體培養(yǎng)基上，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，并記錄單菌落數(shù)，同時(shí)計(jì)算出活菌數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中的pH變化

圖1 枸杞原漿在發(fā)酵過程中的pH值變化

枸杞原漿在發(fā)酵過程中的pH值動(dòng)態(tài)變化如圖1所示。在整個(gè)發(fā)酵過程中，發(fā)酵原漿的整體pH值呈下降趨勢(shì)——起始pH值為4.92，在0～8h之間下降不明顯，8～16h之間下降幅度最大，16h之后趨于平緩，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)pH值達(dá)到3.58。究其緣由，主要是因?yàn)殍坭皆瓭{中的植物乳桿菌利用自身的酶類物質(zhì)、通過EMP途徑降解了枸杞原漿中的碳水化合物（如葡萄糖），進(jìn)而發(fā)酵產(chǎn)生了大量有機(jī)酸（以乳酸為主），增加了發(fā)酵原漿的酸度，降低了pH值。到終點(diǎn)時(shí)pH值得變化趨于平緩，主要是由于乳酸菌進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)生的酸有所減少。

圖2 枸杞原漿在發(fā)酵過程中的枸杞多糖變化

2.2 發(fā)酵過程中枸杞多糖的含量變化

以D-無水葡萄糖為對(duì)照品，以濃度C為縱坐標(biāo)，吸光度A為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到回歸方程：C=0.0698A-0.0017、R2=0.9991，式中A為吸光度，C為枸杞多糖濃度（mg/L）。枸杞多糖在發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)變化如圖2所示，整個(gè)發(fā)酵過程中枸杞多糖呈下降趨勢(shì)——發(fā)酵前多糖含量為2272.25mg/L，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)達(dá)到1271.78mg/L，減少了44.03%。在0～8h之間減速放緩，8～16h之間下降最快，16～40h下降緩慢至趨于平緩，這種趨勢(shì)同pH值的下降趨勢(shì)基本一致。發(fā)酵過程中出現(xiàn)的枸杞多糖變化可能是由于枸杞多糖作為益生元被植物乳桿菌吸收、利用，從而起到了增菌作用[16-17]；也可能因?yàn)殍坭蕉嗵鞘且环N含少量蛋白質(zhì)的多糖復(fù)合物[18-19]，植物乳桿菌利用枸杞多糖作為碳源或植物乳桿菌產(chǎn)生的酶將其降解[20]，生成了小分子物質(zhì)，致使多糖含量降低。而在發(fā)酵前期，植物乳桿菌優(yōu)先利用單糖葡萄糖，后期轉(zhuǎn)為利用多糖。

2.3 發(fā)酵過程中乳酸菌的活菌數(shù)變化

植物乳桿菌的活菌數(shù)在發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)變化如圖3所示，活菌數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間的增加先升高后降低，生長(zhǎng)趨勢(shì)與束文秀等[21]研究中乳酸菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。在0～16h植物乳桿菌的生長(zhǎng)速度較快，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；4h之前緩慢增長(zhǎng)，在12h時(shí)接近達(dá)到了最高點(diǎn)，活菌數(shù)為6.84×109cfu/mL；12～28h時(shí)生長(zhǎng)平緩，處于穩(wěn)定期；28h之后下降明顯。究其緣由，主要是由于發(fā)酵原漿中碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少和代謝產(chǎn)物尤其是酸的產(chǎn)生影響了乳酸菌的生長(zhǎng)。整個(gè)發(fā)酵過程中，活菌數(shù)均處于108cfu/mL以上，說明枸杞對(duì)植物乳桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

圖3 枸杞原漿在發(fā)酵過程中的活菌數(shù)變化

3 結(jié)論與討論

本研究考察了枸杞原漿在發(fā)酵過程中pH值、枸杞多糖和活菌數(shù)的變化規(guī)律。結(jié)果表明，發(fā)酵過程中，pH值和枸杞多糖呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，活菌數(shù)先上升后下降，最終pH值達(dá)到3.58、枸杞多糖含量達(dá)1271.78mg/L、植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)2.57×109cfu/mL。如果將發(fā)酵好的枸杞原漿稀釋100 倍調(diào)配成枸杞飲料，其活菌數(shù)仍可達(dá)到≥106cfu/mL的乳酸菌活菌飲品標(biāo)準(zhǔn)[22]。

本研究中，枸杞多糖減少的結(jié)果不同于許亮[13]研究的枸杞果酒中枸杞多糖先增加后減少的結(jié)果，這種差別可能由于菌種和發(fā)酵條件不同所引起。枸杞多糖的減少反映出植物乳桿菌的代謝對(duì)枸杞有一定的作用或影響，其可能被消耗或降解為其他更容易被人體吸收的物質(zhì)。李越鯤[23]研究的枸杞多糖經(jīng)超聲波降解LBP-s水溶性增強(qiáng)，體外抗氧化活性高于粗多糖，說明多糖降解后也可以發(fā)揮出更好的作用。此外，枸杞多糖也可作為益生元對(duì)乳酸菌起到增殖作用。從益生菌對(duì)人體有益健康的角度開發(fā)產(chǎn)品，在益生菌類產(chǎn)品中添加枸杞多糖等中藥提取物，通過增強(qiáng)益生菌與多糖的協(xié)同作用更利于產(chǎn)品的銷售和消費(fèi)者的青睞。但是發(fā)酵過程中枸杞多糖的變化機(jī)制和具體原因尚未得出明確結(jié)論，需在進(jìn)一步的研究中進(jìn)行探討。