呂艷艷 吳朋飛 王 飛 嚴(yán)會(huì)超 徐 成 王葉元※

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院蠶絲科學(xué)系 廣東廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)藝術(shù)學(xué)院 廣東廣州 510642）

1 前言

家蠶是一種以桑葉為主飼料且能吐絲結(jié)繭的經(jīng)濟(jì)昆蟲，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，家蠶與其它昆蟲相比對(duì)農(nóng)藥更為敏感，蠶體直接接觸或食下被農(nóng)藥嚴(yán)重污染的桑葉時(shí)都會(huì)引起家蠶急性中毒或慢性中毒，因此它是一種我國(guó)農(nóng)藥登記中環(huán)境生態(tài)的非靶標(biāo)生物，也是廣泛用于科學(xué)研究的模式昆蟲之一[1]。

蠶品種、農(nóng)藥類別和發(fā)育階段等多種因素都會(huì)影響到農(nóng)藥對(duì)家蠶的毒性。一般情況下，除蟻蠶外，二齡蠶對(duì)農(nóng)藥最為敏感，對(duì)其他齡期來(lái)說，齡期越大越不敏感。但是五齡期比較特殊，五齡中后期蠶會(huì)對(duì)農(nóng)藥比低齡期更為敏感，即使添食微量的農(nóng)藥也會(huì)導(dǎo)致家蠶結(jié)畸形繭或不結(jié)繭，使羽化后的雌蛾產(chǎn)卵量降低或不產(chǎn)卵。除此之外，也不是所有的農(nóng)藥對(duì)家蠶都表現(xiàn)為急性致死效應(yīng)，因此在評(píng)價(jià)作用機(jī)制比較特殊的殺蟲劑（例如甲氧蟲酰肼）對(duì)家蠶的毒性時(shí)，還應(yīng)對(duì)它的生長(zhǎng)發(fā)育及生理變化等情況做進(jìn)一步觀察和研究[1～2]。

1.1 甲氧蟲酰肼簡(jiǎn)介

農(nóng)藥種類繁多，依據(jù)用途不同可將其分為：殺蟲劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、殺菌劑、殺軟體動(dòng)物劑、殺鼠劑、殺線蟲劑、除草劑等七個(gè)大類。

甲氧蟲酰肼是一種新型的殺蟲劑類型的農(nóng)藥，主要適用于殺害鱗翅目害蟲，在昆蟲發(fā)生自然蛻皮之前的任何時(shí)間它都可以對(duì)昆蟲產(chǎn)生抑制蛻皮作用[3]。其原理是它的結(jié)構(gòu)與鱗翅目昆蟲分泌的蛻皮激素相似，會(huì)導(dǎo)致鱗翅目類昆蟲提前發(fā)生蛻皮反應(yīng)，但是由于體內(nèi)的某些物質(zhì)不足而不能形成新表皮，最后昆蟲會(huì)脫水或者饑餓而最終死亡。甲氧蟲酰肼以觸殺作用為主，也有少量的內(nèi)吸作用。目前甲氧蟲酰肼已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蔬菜、小麥、果樹、棉花等農(nóng)作物的田間鱗翅目害蟲（如甜菜夜蛾）的防治。因此，它成為桑園相鄰的農(nóng)田害蟲防治中比較常用的農(nóng)藥之一。

國(guó)內(nèi)外對(duì)甲氧蟲酰肼的研究較多，主要是研究甲氧蟲酰肼對(duì)鱗翅目類害蟲的毒性。研究表明甲氧蟲酰肼對(duì)棉鈴蟲、玉米螟、甘薯麥蛾、甜菜夜蛾、薊馬、斜紋夜蛾、大螟、美國(guó)白蛾、楊小舟蛾、茶尺蠖、黃夜螟、菜青蟲等多種鱗翅目害蟲都有毒害作用，其中有些是關(guān)于甲氧蟲酰肼對(duì)上述某種鱗翅目害蟲的毒性、安全性評(píng)估、生理生化影響的研究[4～5]。

但關(guān)于甲氧蟲酰肼對(duì)家蠶的研究文獻(xiàn)較少，有關(guān)于甲氧蟲酰肼對(duì)家蠶的發(fā)育、變態(tài)和主要蛋白合成的影響[6]，及阿維菌素和甲氧蟲酰肼兩種農(nóng)藥分別對(duì)家蠶的毒性及混合后對(duì)家蠶的毒性，并根據(jù)毒性測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了安全評(píng)估[7]。

1.2 谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶概況

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，簡(jiǎn)寫GPT）與蠶體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝有關(guān)。

丙氨酸是蠶絲的主要合成原料，故丙氨酸的生成量能夠在很大程度上影響蠶絲的生成量。而丙氨酸的合成有兩條主要途徑：I. 桑葉里的大量天門冬氨酸可以通過谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用及草酰乙酸的脫酸作用生成丙氨酸；II. 在輔酶Ⅰ的遞氫作用下，乳酸脫氫酶與谷氨酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，并在谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成丙氨酸。在這兩條途徑中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶都發(fā)揮了重要的作用，因此谷丙轉(zhuǎn)氨酶可以作為預(yù)測(cè)蠶桑經(jīng)濟(jì)性狀的重要指標(biāo)之一。

谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-oxalacetic transaminase，簡(jiǎn)寫GOT）也是蠶體內(nèi)一種比較重要的酶，它大量存在于家蠶后部絲腺，跟谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用一樣，可以把谷氨酸轉(zhuǎn)化為絲素蛋白的主要氨基酸之一——甘氨酸。谷草轉(zhuǎn)氨酶也可以作為桑蠶經(jīng)濟(jì)性狀的重要生化指標(biāo)。

一些研究結(jié)果表明家蠶后部絲腺的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性與家蠶的繭質(zhì)相關(guān)，五齡第三天呈顯著正相關(guān)，第五天則相關(guān)不顯著，第七天卻變?yōu)闃O顯著負(fù)相關(guān)。因此這兩種酶可作為預(yù)測(cè)家蠶產(chǎn)絲量的重要生化指標(biāo)[9]。

關(guān)于蠶體不同部位谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量的研究，劉限[10]測(cè)定了春柞蠶不同品種的中部、后部絲腺的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，研究結(jié)果表明谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量是影響蠶絲質(zhì)量的重要指標(biāo)。關(guān)于蠶體內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶的研究則特別少，關(guān)于谷草轉(zhuǎn)氨酶的研究大部分都是關(guān)于人體肝臟的。研究農(nóng)藥對(duì)動(dòng)物的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量的影響[11～13]，主要研究對(duì)象有魚類、哺乳動(dòng)物類等。張彬彬[11]研究了農(nóng)藥乙草胺對(duì)泥鰍肝臟內(nèi)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性的影響，主要通過不同濃度的乙草胺溶液浸泡泥鰍不同的時(shí)間后，測(cè)定泥鰍肝臟內(nèi)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶來(lái)研究該農(nóng)藥對(duì)泥鰍生理生化的影響，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用乙草胺處理泥鰍一定時(shí)間可誘導(dǎo)其組織內(nèi)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性提高，除此之外乙草胺濃度和暴露時(shí)間與泥鰍的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性變化存在一定的劑量、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

1.3 研究意義及目的

家蠶是一種鱗翅目昆蟲，它是以桑葉為主飼料的寡食性昆蟲，其生長(zhǎng)發(fā)育容易受到環(huán)境、飼料、病原微生物等因素影響，特別是桑園種植規(guī)模零星、分散，或與其它農(nóng)作物混種，由于農(nóng)藥使用不規(guī)范，環(huán)境污染越來(lái)越嚴(yán)重，養(yǎng)蠶安全逐漸受到關(guān)注。本文研究添食不同濃度的甲氧蟲酰肼對(duì)家蠶體內(nèi)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響，為家蠶的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和制定家蠶安全健康養(yǎng)殖措施提供數(shù)據(jù)參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 藥品和試劑

谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（南京建成生物研究所），谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（南京建成生物研究所），無(wú)水乙醇，85 %磷酸溶液，生理鹽水，考馬斯亮藍(lán) G-250 ，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，99.1 %甲氧蟲酰肼原藥（由上海市農(nóng)藥研究所有限公司生產(chǎn)，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所供應(yīng)）。

2.1.2 儀器設(shè)備

玻璃十字柄勻漿器，離心機(jī)，天平，制冰機(jī)，冰箱，離心管，移液槍，量筒，燒杯，水浴鍋，紫外分光光度儀，容量瓶，錐形瓶，試管，比色皿，試管架，烘箱，玻璃棒。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

9·芙蠶品種，由廣東省蠶業(yè)技術(shù)推廣中心提供。

2.2 方法

2.2.1 甲氧蟲酰肼添食方法

將桑葉完全浸泡在不同濃度的甲氧蟲酰肼溶液 10 s后，晾干，給家蠶添食。

2.2.1.1 二、三齡蠶添食方法

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，96 h LC50為 0.144 mg a.i./L及GB/T31270.11 -2014 化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第 11部分：家蠶急性毒性試驗(yàn)、中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——化學(xué)農(nóng)藥 家蠶慢性毒性試驗(yàn)準(zhǔn)則（征求意見稿）。將二、三齡蠶分為9個(gè)組，一個(gè)空白對(duì)照組，一個(gè)溶劑對(duì)照組和 7個(gè)不同濃度的甲氧蟲酰肼添食組，組距為 1.5，每組 3個(gè)平行，每個(gè)平行 25 頭蠶，同時(shí)在相同條件下養(yǎng)第四個(gè)平行30 頭蠶以備用。每組的編號(hào)及添食操作情況如表1。

其中受試物濃度的配置方法是：①稱取 0.01261 g受試物，用 0.4 mL N,N-二甲基甲酰胺和 0.025 g吐溫 80 溶解后，加入適量去離子水，轉(zhuǎn)移進(jìn)50 mL容量瓶中，定容得到濃度為250 mg a.i./L的受試物溶液。②將該濃度的受試物濃度用去離子水稀釋到所需濃度。③溶劑對(duì)照組配制方法主要為先量取0.4mL N,N-二甲基甲酰胺和0.025 g吐溫80 加入50 mL容量瓶中，用去離子水定容至標(biāo)線，得到溶劑對(duì)照組貯備液1。從中取0.5 mL于50 mL容量瓶中，用去離子水定容至標(biāo)線，得到溶劑對(duì)照組貯備液 2。④從溶劑對(duì)照組貯備液2中量取6.40 mL于200 mL容量瓶，配制成溶劑對(duì)照組溶液。

表1 浸葉法—試驗(yàn)分組及濃度設(shè)計(jì)

空白組的桑葉不用浸泡。試驗(yàn)組和溶劑對(duì)照組在二齡起至三齡末期間添食不同濃度處理的桑葉，四至五齡添食正常桑葉。五齡第八天取樣蠶，-80 ℃的冰箱中保存以備使用。

2.2.1.2 五齡蠶添食方法

五齡家蠶采用同樣的分組方法，組距為1.8，受試物的配置方法與 2.2.1.1相同，但是受試物濃度分別為 1.63 ×10-4mg.a.i./L，2.94 ×10-4mg.a.i./L，5.29 ×10-4mg.a.i./L，9.53×10-4mg.a.i./L，1.71 ×10-3mg.a.i./L，3.09 ×10-3mg.a.i./L，5.56 ×10-3mg.a.i./L。從五齡起開始喂食，在五齡第八天取樣。

2.2.2 組織液獲取方法

在五齡第八天，每組的每個(gè)平行中隨機(jī)取1頭蠶，每組共3頭蠶，在-80 ℃存儲(chǔ)。實(shí)驗(yàn)前取出蠶稱重，再與其體重9倍的生理鹽水混合后用玻璃十字柄勻漿器在冰水環(huán)境下研磨混勻后倒入離心管離心，2500 r/min離心10 min后，取上清液2 mL保存于離心管中做標(biāo)記，并將這些標(biāo)記好的上清液存于-40 ℃的冰箱中保存以待測(cè)量。剩余的上清液取出放入一個(gè)離心管內(nèi)標(biāo)記好保存在-40 ℃冰箱中另放好以備用。

2.2.3 測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法

主要采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定[14]。

2.2.4 谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定

按試劑盒要求操作。

2.2.5 谷草轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定

按試劑盒要求操作。

2.2.6 數(shù)據(jù)分析處理

本次數(shù)據(jù)分析使用的軟件主要是 Microsoft Office家庭版和學(xué)生版2016 的Exce1和SPSS.24.0。Excel用來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)濃度及谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量。SPSS軟件主要通過單因素方差分析比較來(lái)對(duì)添食不同濃度甲氧蟲酰肼的最終酶含量與對(duì)照組進(jìn)行顯著性差異分析（P＜0.05）。如果差異性達(dá)到顯著關(guān)系再用Duncan’s多重比較分析。數(shù)據(jù)分析的結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差a，b…”呈現(xiàn)。寫字母代表Duncan’s多重分析結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

蛋白質(zhì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果如表 2。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，得到的回歸方程為y=0.0006 x-0.0213 ，用該公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，見表3。

表2 蛋白質(zhì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

圖1 測(cè)定蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.2 蛋白質(zhì)濃度結(jié)果

表3 蛋白質(zhì)濃度結(jié)果

3.2 酶含量的測(cè)定結(jié)果

3.2.1 二三齡期添食酶含量

表4 二、三齡添食酶含量測(cè)定結(jié)果

從表 4可以看出，二、三齡蠶谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，除了T3和 T7兩組之外，其它試驗(yàn)組與對(duì)照組間都有顯著性增加。谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，除了 T3和 T7兩組，其它試驗(yàn)組與對(duì)照組之間有顯著性增加。

3.2.2 五齡期添食酶含量

表5 五齡添食酶含量測(cè)定結(jié)果

五齡添食酶含量測(cè)定結(jié)果見表 5，谷草轉(zhuǎn)氨酶活性除了T4、T6和T7試驗(yàn)組的結(jié)果顯著低于空白對(duì)照組外，其他試驗(yàn)組與空白對(duì)照組都沒有顯著差異，且所有試驗(yàn)組都與溶劑對(duì)照組沒有顯著差異。谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，試驗(yàn)組 T2、T3、T5、T6與空白對(duì)照組之間有顯著增加；而與溶劑對(duì)照組相比，則只有T3和T5兩組有顯著差異。

4 討論與結(jié)論

4.1 討論

4.1.1 不同齡期對(duì)農(nóng)藥敏感性不一樣

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，二、三齡蠶添食甲氧蟲酰肼，除了濃度為 2.27 ×10-3mg.a.i./L，1.40 ×10-2mg.a.i./L，其他添食濃度谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量有顯著增加。而五齡添食甲氧蟲酰肼，則大部分濃度都不會(huì)導(dǎo)致兩種酶的含量顯著增加，該結(jié)果與來(lái)有鵬[1]認(rèn)為家蠶不同齡期對(duì)農(nóng)藥的敏感程度是不一樣的結(jié)論相符。

4.1.2 家蠶生理變化與繭質(zhì)調(diào)查結(jié)果

課題組后續(xù)調(diào)查了添食上述不同濃度的甲氧蟲酰肼對(duì)家蠶繭質(zhì)的影響，結(jié)果表明二、三齡添食的蠶，試驗(yàn)組全繭量、繭層量、繭層率和蛹重都相對(duì)對(duì)照組隨濃度的增加而降低，但經(jīng)生物統(tǒng)計(jì)分析它們之間均無(wú)顯著差異。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推測(cè)可能是二、三齡添食甲氧蟲酰肼后，導(dǎo)致蠶體內(nèi)蛋白代謝紊亂，故蠶體組織內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性總體上有所增加，此時(shí)蠶體吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要用于生長(zhǎng)發(fā)育，并不是用于合成絲物質(zhì)和造卵，故對(duì)蠶體后部絲腺的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量并沒有顯著的變化，因此對(duì)繭質(zhì)影響不大。

五齡蠶添食，試驗(yàn)組全繭量、繭層量、繭層率和蛹重都相對(duì)對(duì)照組有顯著降低，并呈現(xiàn)出隨濃度的增加而降低的規(guī)律。五齡一直添食甲氧蟲酰肼，導(dǎo)致蠶體組織蛋白代謝紊亂，五齡期蠶消化吸收的營(yíng)養(yǎng)主要用于絲物質(zhì)合成，我們測(cè)定的是第八天的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量，有些濃度有差異、有些沒差異，可能我們測(cè)的是蠶體，而不能完全反應(yīng)絲腺組織的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶，彭衛(wèi)平[9]研究結(jié)果認(rèn)為家蠶后部絲腺的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性與家蠶的繭質(zhì)相關(guān)，五齡第三天呈顯著正相關(guān)，第五天則相關(guān)不顯著，第七天為卻變?yōu)闃O顯著負(fù)相關(guān)。可能不同濃度的酶活性與家蠶繭質(zhì)也存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。

4.1.3 建議

本實(shí)驗(yàn)只研究了不同齡期和不同濃度的甲氧蟲酰肼對(duì)蠶的影響。甲氧蟲酰肼對(duì)蠶的毒性影響不僅受到齡期，藥物濃度等因素的影響，它還可能受到蠶品種，添食方法等多種因素影響。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明即使是微量的甲氧蟲酰肼也會(huì)對(duì)家蠶的生理造成一定的影響，并會(huì)對(duì)繭質(zhì)造成影響。因此，建議桑園一定要建立在遠(yuǎn)離可能會(huì)使用甲氧蟲酰肼等農(nóng)藥的農(nóng)田，除此之外，也要十分注意桑園用水是否會(huì)受到甲氧蟲酰肼污染。

4.2 小結(jié)

不同齡期蠶食下不同濃度甲氧蟲酰肼的桑葉，谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量的變化規(guī)律不同。二、三齡蠶添食，除了個(gè)別濃度，大部分濃度蠶體內(nèi)的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶都有顯著增加。而五齡蠶只有個(gè)別濃度蠶體的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶有顯著差異。