田雨佳，郭 鵬，李勝利，張學(xué)煒*，郭 爽

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；2. 北京好友巡天生物技術(shù)有限責(zé)任公司，北京100081；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；4. 天津市奶業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300210）

“張雜谷”是我國(guó)自主培育的具有高產(chǎn)、節(jié)水、耐干旱、耐貧瘠、抗倒伏等特點(diǎn)的禾本科糧食作物[1]。張雜谷谷草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，用其代替奶牛及羊日糧中部分粗飼料具有很好的飼喂效果[2-3]，但張雜谷谷草的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值仍可提升。常見的提升粗飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值方法有物理法、化學(xué)法和生物法[4]，其中，微生物發(fā)酵處理是目前最為常見的方法之一。微生物處理秸稈的主要優(yōu)勢(shì)是微生物產(chǎn)生的特殊酶可以破壞秸稈的細(xì)胞壁，可降解部分連接緊密的木質(zhì)素形成大量的空洞，使粗飼料中的纖維更容易與動(dòng)物體內(nèi)的酶結(jié)合而被消化[5]。Yu等[6]報(bào)道，不同飼料的蛋白質(zhì)和碳水化合物分子結(jié)構(gòu)特征不同會(huì)影響飼料在反芻動(dòng)物瘤胃中與微生物酶的結(jié)合和降解，進(jìn)而影響飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。近幾年，光譜技術(shù)的進(jìn)步使得分子結(jié)構(gòu)特征的測(cè)定得以實(shí)現(xiàn)。傅里葉變換紅外光譜（DRⅠFT或ATR-FT/ⅠR）技術(shù)是一種無(wú)損非接觸的分析技術(shù)，可以獲得飼料的蛋白質(zhì)及碳水化合物分子結(jié)構(gòu)特征圖譜，進(jìn)而揭示差異或改變。目前，科學(xué)家們已利用光譜技術(shù)研究了苜蓿、餅粕類、DDGS等飼草和飼料的蛋白質(zhì)及碳水化合物結(jié)構(gòu)特征以及與常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的相關(guān)性，并建立了較為成熟的分析方法[7-8]。蛋白質(zhì)基線在ca.1 718～1 482 cm-1、碳水化合物基線在ca.1 200～800 cm-1的傅里葉變換紅外光譜可呈現(xiàn)蛋白質(zhì)及碳水化合物的結(jié)構(gòu)圖譜[9]。

本試驗(yàn)利用傅里葉變換紅外光譜（ATR-FT/ⅠR）掃描技術(shù)，測(cè)定微生物發(fā)酵處理張雜谷谷草與普通張雜谷谷草的分子結(jié)構(gòu)特征，分析常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)與分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，從分子水平揭示微生物厭氧發(fā)酵對(duì)張雜谷谷草營(yíng)養(yǎng)的影響及引起變化的根本原因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品 選擇河北省張家口地區(qū)的3個(gè)地塊，每個(gè)地塊采集抽穗期張雜谷谷草收割后的樣品10 kg，一半曬干制成干草，粉碎后過(guò)40目分析篩保存?zhèn)溆?，另一半切短?～8 cm，將復(fù)合菌種（布氏乳桿菌、黑曲霉菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌、里氏木酶菌等）制成的發(fā)酵劑于25～35℃的生長(zhǎng)因子營(yíng)養(yǎng)液中活化0.5～1.5 h，選擇活化后2 h活菌數(shù)達(dá)到20億/mL的細(xì)菌液（發(fā)酵劑來(lái)源于北京好友巡天生物技術(shù)有限責(zé)任公司），噴灑到張雜谷谷草上，在環(huán)境溫度20～35℃、濕度40%～60%條件下，將5 kg張雜谷谷草放置于聚乙烯厭氧發(fā)酵罐（10 L /個(gè)）中，以每個(gè)地塊設(shè)置為1個(gè)重復(fù)（n=3），厭氧發(fā)酵7 d制成發(fā)酵張雜谷谷草，然后風(fēng)干、粉碎處理，并過(guò)40目分析篩保存?zhèn)溆?。即微生物厭氧發(fā)酵張雜谷谷草3個(gè)重復(fù)，普通張雜谷谷草3個(gè)重復(fù)。

1.2 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 根據(jù)AOAC標(biāo)準(zhǔn)（1990）[10]測(cè)定發(fā)酵處理與普通張雜谷谷草粗蛋白質(zhì)（CP）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）含量，采用硫酸-蒽酮比色法[11]測(cè)定水溶性碳水化合物（WSC）含量，每個(gè)重復(fù)3個(gè)平行。

1.3 分子結(jié)構(gòu)分析

1.3.1 圖譜采集 將樣品進(jìn)一步粉碎過(guò)0.25 mm分析篩，啟動(dòng)Lambda ATR-FT/ⅠR（天津港東科技有限公司），選擇掃描波長(zhǎng)范圍為ca. 4 000～800 cm-1，掃描次數(shù)64次，每個(gè)樣品平行掃描10次，同時(shí)采集背景圖譜以扣除環(huán)境的影響。將所采集圖譜由GⅠF格式轉(zhuǎn)化為CSV格式，等待分析。

1.3.2 分子結(jié)構(gòu)圖譜分析 利用OMNⅠC 7.5圖譜分析軟件，逐步解析厭氧處理前與處理后張雜谷谷草所采集的圖譜。其中，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)特征參數(shù)包括酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺 ⅠⅠ區(qū)的峰高（A_Ⅰ_H、A_Ⅱ_H）及峰面積（A_Ⅰ_A、A_Ⅱ_A）、酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺ⅠⅠ區(qū)的峰面積總和（S_Ⅰ_Ⅱ_A）、酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺ⅠⅠ區(qū)的面積（R_Ⅰ_Ⅱ_A）及峰高度比值（R_Ⅰ_Ⅱ_H）；總碳水化合物分子結(jié)構(gòu)特征參數(shù)包括總碳水化合物吸收峰中3個(gè)小峰的峰高、峰面積以及總碳水化合物吸收峰總面積。

1.4 分子結(jié)構(gòu)與營(yíng)養(yǎng)成分相關(guān)性分析 分析厭氧處理前與處理后張雜谷谷草蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征參數(shù)與CP的相關(guān)性；碳水化合物分子結(jié)構(gòu)特征參數(shù)與NDF、ADF和WSC的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 CP、NDF、ADF、WSC含量與分子結(jié)構(gòu)單變量圖譜數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 9.2進(jìn)行單因素Duncan's方差分析，利用CORR程序中Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)酵張雜谷谷草與普通張雜谷谷草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分由表1可見，發(fā)酵張雜谷谷草WSC含量顯著高于普通張雜谷谷草（P＜0.05），發(fā)酵處理與未處理張雜谷谷草的CP、NDF及ADF無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

2.2 發(fā)酵張雜谷谷草與普通張雜谷谷草的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分析 由表2可見，發(fā)酵張雜谷谷草的（S_Ⅰ_Ⅱ_A）、酰胺Ⅰ和ⅠⅠ的峰高比值（R_Ⅰ_Ⅱ_H）顯著低于普通張雜谷谷草（P＜0.05），（A_Ⅱ_H）則顯著高于普通張雜谷谷草（P＜0.05）；發(fā)酵與普通張雜谷谷草的其他蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.3 發(fā)酵張雜谷谷草與張雜谷谷草的碳水化合物分子結(jié)構(gòu)分析 由表3可見，發(fā)酵張雜谷谷草的總碳水化合物第一、二、三亞峰峰高（TCHO_1_H、TCHO_2_H、TCHO_3_H） 和 峰 面 積 (TCHO_1_A、TCHO_2_A、TCHO_3_A）以及總碳水化合物峰面積(TCHO_A)均顯著高于普通張雜谷谷草（P＜0.05），表明微生物發(fā)酵可提高總碳水化合物含量。

表2 發(fā)酵張雜谷谷草與普通張雜谷谷草的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分析（n=3）

2.4 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分與分子結(jié)構(gòu)特征參數(shù)的相關(guān)性

2.4.1 CP與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)特征參數(shù)的相關(guān)性 由表4可見，CP與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的A_Ⅰ_H呈顯著的正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.67。CP與其他蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。

2.4.2 NDF、ADF、WSC與碳水化合物分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性 表5顯示，WSC含量與TCHO_1_A呈顯著正相關(guān)（r=0.61，P＜0.05），與TCHO_2_H呈顯著正相關(guān)（r=0.61，P＜0.05）。NDF、ADF與碳水化合物分子結(jié)構(gòu)特征參數(shù)之間無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

3.1 微生物厭氧發(fā)酵處理對(duì)張雜谷谷草CP含量和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)特征的影響 在生產(chǎn)中，常用CP含量判斷飼料的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但即使2種飼料CP含量相近，蛋白質(zhì)內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)也不盡一致[12]。本研究結(jié)果顯示，CP與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的A_Ⅰ_H呈顯著正相關(guān)，但發(fā)酵張雜谷谷草與普通張雜谷谷草的A_Ⅰ_H無(wú)顯著差異，進(jìn)一步證實(shí)了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)差異不會(huì)直接反映在CP含量上。

本試驗(yàn)中，發(fā)酵張雜谷谷草與普通張雜谷谷草CP含量無(wú)顯著差異，但發(fā)酵張雜谷谷草的A_Ⅰ_A與A_ⅠⅠ_A 之和、R_Ⅰ_ⅠⅠ_H 顯著低于普通張雜谷谷草，A_ⅠⅠ_H則顯著高于普通張雜谷谷草。說(shuō)明發(fā)酵張雜谷谷草與普通張雜谷谷草的蛋白質(zhì)分子有差異，不同之處主要在酰胺ⅠⅠ區(qū)。研究表明，酰胺Ⅰ區(qū)主要由C=O伸展振動(dòng)和少量的C-N伸展振動(dòng)構(gòu)成；酰胺ⅠⅠ區(qū)主要由N-H 彎曲、C-N 伸展和少量的C=O伸展、C-C伸展和N-C伸展組成[13]。影響因素包括飼料品質(zhì)、轉(zhuǎn)基因處理，壓榨、發(fā)酵等加工方法，蛋白質(zhì)酰胺ⅠⅠ區(qū)的差異會(huì)影響動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的利用和消化[14]。

蛋白質(zhì)分子光譜結(jié)構(gòu)特性可能會(huì)影響蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)的代謝特性。不同飼料種類、不同加工處理后瘤胃降解參數(shù)與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)存在差異[15]。結(jié)合本試驗(yàn)的張雜谷谷草營(yíng)養(yǎng)成分和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)結(jié)果，說(shuō)明發(fā)酵處理與未處理張雜谷谷草可為動(dòng)物提供相似的CP水平，但由于二者酰胺ⅠⅠ區(qū)顯著不同，說(shuō)明蛋白質(zhì)組分能夠被動(dòng)物利用的程度可能也會(huì)不同，有待于后續(xù)通過(guò)動(dòng)物消化試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

表3 發(fā)酵張雜谷谷草與普通張雜谷谷草的碳水化合物分子結(jié)構(gòu)分析

表4 發(fā)酵張雜谷谷草與普通張雜谷谷草CP與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)特征參數(shù)的相關(guān)性

表5 發(fā)酵張雜谷谷草與普通張雜谷谷草NDF、ADF、WSC與碳水化合物分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

3.2 微生物厭氧發(fā)酵處理對(duì)張雜谷谷草碳水化合物成分及其分子結(jié)構(gòu)特征的影響 飼料碳水化合物包括結(jié)構(gòu)性碳水化合物和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵張雜谷谷草NDF及ADF等結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量與普通張雜谷谷草差異不顯著，可能是發(fā)酵時(shí)間太短導(dǎo)致；但非結(jié)構(gòu)性碳水化合物WSC含量顯著高于普通張雜谷谷草；WSC含量與TCHO_1_A、TCHO_2_A均呈正相關(guān)。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼料淀粉和NFC含量與總碳水化合物呈正相關(guān)，這與本研究結(jié)果相似，說(shuō)明TCHO_1_H、TCHO_2_H越高，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量越高。另外，發(fā)酵張雜谷谷草TCHO_1_A顯著高于普通張雜谷谷草（0.59 vs. 0.22）；發(fā)酵張雜谷谷草的TCHO_2_A也顯著高于普通張雜谷谷草組（2.85 vs.0.66），可能是造成發(fā)酵張雜谷谷草WSC含量顯著高于普通張雜谷谷草的主要原因。究其深層次原因，可能是復(fù)合細(xì)菌產(chǎn)生的特殊酶可以破壞谷草稈的細(xì)胞壁，進(jìn)而釋放張雜谷谷草莖稈內(nèi)部的營(yíng)養(yǎng)組分。

4 結(jié) 論

微生物厭氧發(fā)酵處理對(duì)張雜谷谷草 CP含量無(wú)顯著影響，但會(huì)影響蛋白質(zhì)酰胺ⅠⅠ區(qū)分子結(jié)構(gòu)。微生物厭氧發(fā)酵處理張雜谷谷草會(huì)改變總碳水化合物的分子結(jié)構(gòu)，顯著提高各特征參數(shù)的峰值和峰面積，進(jìn)而提高WSC含量和碳水化合物的潛在利用率。