王 雪,黃建忠，李 力

(福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350108)

基因敲除技術(shù)，又名基因打靶，自20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)，主要建立在同源重組的基礎(chǔ)上，屬于一種新型分子生物學(xué)技術(shù)。經(jīng)典的基因敲除技術(shù)是指通過(guò)同源重組原理將標(biāo)記基因定點(diǎn)地整合入目標(biāo)細(xì)胞基因組上某一特定的位點(diǎn)，以達(dá)到細(xì)胞內(nèi)某一目的基因敲除的一種技術(shù)?；蚯贸夹g(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物、微生物，應(yīng)用形式多種多樣，主要有同源重組法、隨機(jī)插入突變法、RNA干擾法、ZFNs法、TALEs法，此外，還有目前熱點(diǎn)研究的CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)?；谕粗亟M的基因敲除技術(shù)主要有RecA系統(tǒng)同源重組法、Red系統(tǒng)同源重組法、基于自殺載體的同源重組法、基于溫敏型質(zhì)粒的同源重組法。這四種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，要根據(jù)不同的微生物不同的條件選擇不同的方法，其基本原理如圖1。基因敲除技術(shù)的熱門也使得一大批發(fā)明專利涌現(xiàn)。本文對(duì)幾種廣泛應(yīng)用于微生物的基因敲除方法進(jìn)行介紹，并提供一些成功案例及發(fā)明專利，各種方法的比較見(jiàn)表1。

圖1 同源重組法進(jìn)行基因敲除的一般原理Fig.1 Ceneral principles of gene knockout by homologous recombination

表1 基因敲除方法的比較Table 1 Comparison of gene knockout methods

注：“-”表示無(wú)特定質(zhì)粒

1 基因敲除技術(shù)原理

1.1 RecA系統(tǒng)同源重組法

RecA同源重組系統(tǒng)是大腸埃希菌中的內(nèi)源性同源重組機(jī)制，組成它的蛋白質(zhì)包括RecA蛋白和RecBCD等[1]。RecA具有雙重功能，它不但能改變單鏈的DNA分子還可以激活蛋白酶，是大腸埃希菌recA基因座的產(chǎn)物，具有單、多聚體兩種形式，可以參與大腸埃希菌中任何同源重組機(jī)制。RecA蛋白是纖維狀的，能夠參與DNA損傷的修復(fù)，總的來(lái)說(shuō)，它有兩個(gè)主要功能，一是能夠促進(jìn)DNA分子鏈之間的交換，二是作為共蛋白酶可以促進(jìn)阻遏蛋白LexA的自我水解，蛋白R(shí)ecBCD就是三種蛋白質(zhì)RecB、RecC、RecD的復(fù)合體，這三種蛋白質(zhì)可以解開(kāi)DNA雙鏈，在Chi位點(diǎn)處形成DNA單鏈[2]。但是通過(guò)RecA系統(tǒng)難以成功獲得基因缺失突變株，其具有以下3個(gè)缺點(diǎn)：①重組的概率很低；②構(gòu)建重組載體時(shí)需要的同源臂較長(zhǎng)；③RecBCD蛋白具有核酸外切酶的活性，可以降解線性的DNA片段給替換載體的構(gòu)建帶來(lái)了困難。因此，由于RecA同源重組系統(tǒng)需要依賴于特定的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并且需要的同源臂較長(zhǎng)，具有操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，現(xiàn)已很少被使用[3]。

1.2 Red系統(tǒng)同源重組法

Red重組系統(tǒng)來(lái)源于λ噬菌體，包括Exo、Beta、Gam3三種蛋白質(zhì)，進(jìn)行基因敲除時(shí)將編碼這三種蛋白質(zhì)的基因克隆入載體，利用基因翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，使得同源基因重組能夠順利進(jìn)行。在這三種蛋白質(zhì)中Exo蛋白具有λ核酸外切酶活性，能夠從DNA單鏈的5′端向3′端降解，最后產(chǎn)生3′突出末端而Beta蛋白恰能與這個(gè)有3′突出末端的DNA片段結(jié)合，介導(dǎo)其互補(bǔ)鏈的退火且保護(hù)這個(gè)DNA分子不被降解，最重要的是Exo蛋白有重組酶活性可以促使同源重組，Gam蛋白的作用則是防止導(dǎo)入目的菌株的DNA分子被核酸外切酶降解，其分子量約為16 000 Da，與核酸外切酶結(jié)合能夠有效抑制核酸外切酶的活性[4]。微生物在Red系統(tǒng)的作用下能夠明顯提高同源重組發(fā)生的概率，具有效率高的優(yōu)點(diǎn)。2000年首創(chuàng)兩步同源重組法，在輔助性質(zhì)粒pKD46中表達(dá)Red同源重組系統(tǒng)，在構(gòu)建質(zhì)粒載體的過(guò)程中，設(shè)計(jì)引物所需的同源臂長(zhǎng)度得到了大大縮短，克服了RecA系統(tǒng)同源重組法復(fù)雜、同源臂長(zhǎng)的缺點(diǎn)[5]。Red同源重組技術(shù)的主要研究對(duì)象是大腸埃希菌，但同時(shí)它還能夠應(yīng)用于其他細(xì)菌甚至病毒中，兩步同源重組法是Red系統(tǒng)同源重組方法中最經(jīng)典的方法，該方法目前得到廣泛應(yīng)用。所謂兩步同源重組法就是第一步同源重組質(zhì)粒與染色體上的靶基因進(jìn)行替換，第二步利用pCP20質(zhì)粒將抗性基因敲除掉。下面就兩步同源重組法的一般策略加以說(shuō)明：①將帶有Red重組系統(tǒng)的pKD46質(zhì)粒導(dǎo)入目的菌株，使目的菌株能夠產(chǎn)生三種蛋白重組酶，為基因敲除做準(zhǔn)備；②構(gòu)建重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒兩側(cè)有靶基因的上下游同源臂，中間是一段抗性基因，含有FRT位點(diǎn)；③制備感受態(tài)細(xì)胞，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入目的菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，要事先加入L-阿拉伯糖，它可以誘導(dǎo)Red重組系統(tǒng)中三種蛋白質(zhì)的表達(dá)，促進(jìn)同源重組；④在LB培養(yǎng)基上加入相應(yīng)的抗性基因，進(jìn)行重組子的篩選，能夠在加有抗生素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株就是發(fā)生了基因敲除的突變體；⑤將溫敏型質(zhì)粒pCP20導(dǎo)入突變菌株中，用來(lái)消除抗性基因；⑥42 ℃培養(yǎng)24 h以上，去除溫敏型質(zhì)粒pKD46。Wang等[6]利用兩步同源重組法成功敲除了畢赤酵母中α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(ochlp)基因，得到ochl基因缺失突變株，研究了融合蛋白(HAS/GM-CSE)的表達(dá)。兩步同源重組法只是Red系統(tǒng)重組法中最為重要最為經(jīng)典的一種，在此基礎(chǔ)上又發(fā)展出其他一些方法，比如雙質(zhì)?；蚯贸?、單質(zhì)粒基因敲除法，較兩步同源重組法又有一些新的優(yōu)點(diǎn)，雙質(zhì)?；蚯贸ㄓ脙蓚€(gè)質(zhì)粒，其中一個(gè)為輔助性質(zhì)粒，另一個(gè)為供體質(zhì)粒。單基因敲除法只需一個(gè)質(zhì)粒就能完成敲除，在染色體上沒(méi)有殘余序列。

在實(shí)際的基因敲除操作中往往都是Red兩步同源重組法的延伸，根據(jù)不同的菌株與操作條件適當(dāng)取舍。蘇莉等[7]采用Red重組方法依次對(duì)腸出血性大腸埃希菌(EHEC)O157∶H7的Z1444和Z0986基因進(jìn)行敲除，成功構(gòu)建出敲除卡那霉素抗性基因的雙缺失突變株。楊冬美等[8]從野生型菌株E.coliW3110出發(fā)，利用Red系統(tǒng)同源重組法，將大腸埃希菌tdcC、sstT、和livJ系統(tǒng)基因敲除，得到單缺失和雙缺失菌株，考察了相應(yīng)系統(tǒng)缺失對(duì)胞外L-蘇氨酸積累的影響。Shi等[9]采用Red系統(tǒng)同源重組，對(duì)絲氨酸吸收系統(tǒng)進(jìn)行多基因敲除，得到單基因敲除、雙基因敲除及三基因敲除等11個(gè)突變菌株，成功考察了對(duì)大腸埃希菌產(chǎn)L-絲氨酸的影響。楊益等[10]通過(guò)設(shè)計(jì)長(zhǎng)引物，PCR擴(kuò)增出帶有SAT1flipper的CaCsC1基因敲除盒，對(duì) Red兩步同源重組法加以延伸，成功得到敲除了兩個(gè)等位基因的白念珠菌CaCsC1基因缺失株。與傳統(tǒng)的白念珠菌基因敲除方法相比較不需要構(gòu)建克隆載體，比較簡(jiǎn)單，用FRT序列替代靶基因，沒(méi)有NAT抗性，從而減少外源基因的插入對(duì)菌株造成的影響?？偟膩?lái)說(shuō)，應(yīng)用Red同源重組策略主要有四種[11]：①一次篩選：即兩側(cè)為同源臂中間為篩選標(biāo)記基因的DNA片段與染色體上的靶基因發(fā)生同源重組，篩選標(biāo)記基因取代靶基因，標(biāo)記基因留在染色體上；②一次篩選，一次位點(diǎn)專一性重組：這種Red同源重組策略是在一次篩選的基礎(chǔ)上，利用位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)去除篩選標(biāo)記基因，來(lái)源于F1噬菌體的cre/loxP系統(tǒng)就可以介導(dǎo)位點(diǎn)特異性DNA重組，此外還有Ftp/FRT重組系統(tǒng)。Tamakawa等[12]通過(guò)cre-loxP系統(tǒng)重組法成功對(duì)C.utilis基因(CuPDC)進(jìn)行了敲除。cre-loxP系統(tǒng)主要應(yīng)用于多倍體的敲除，尤其是在食品酵母基因無(wú)痕敲除方面的應(yīng)用[13]；③一次篩選，一次限制性核酸酶酶切：這種技術(shù)也可以將標(biāo)記基因去除，同時(shí)還可以留下一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。王立東等[14]在研究乙醛脫氫酶基因?qū)γ鞔榫a(chǎn)甘露醇影響時(shí)，首先構(gòu)建了攜帶四環(huán)素抗性基因的同源重組載體，然后利用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切去除抗性標(biāo)記基因，產(chǎn)生無(wú)抗性標(biāo)記上的同源重組載體，最終獲得乙醛脫氫酶基因敲除突變菌株；④兩次篩選：構(gòu)建的基因置換載體有兩個(gè)篩選標(biāo)記基因，通常為一個(gè)抗性基因，一個(gè)致死基因，如sacB有時(shí)也稱為反向篩選標(biāo)記基因。

1.3 基于自殺載體的同源重組法

所謂自殺質(zhì)粒(suicide plasmid)就是指當(dāng)某一特定質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，要么整合到宿主染色體上，要么因?yàn)椴荒軓?fù)制而被消除掉，這是因?yàn)樽詺①|(zhì)粒的復(fù)制需要一種特殊的蛋白質(zhì)，如果宿主不能夠產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)，除非整合到染色體上，那么就不能繼續(xù)存在，這就是自殺質(zhì)粒用來(lái)作為基因敲除工具的理論基礎(chǔ)。因此，不同的微生物需要選擇不同的自殺質(zhì)粒，在目的菌株中自殺質(zhì)粒迫于生存的需要，會(huì)促使自身與染色體發(fā)生整合，利用一定的方法，將含有目的基因同源臂的DNA片段克隆至自殺載體，這個(gè)自殺載體上通常需要兩個(gè)篩選標(biāo)記，一個(gè)正篩選標(biāo)記，一個(gè)負(fù)篩選標(biāo)記，當(dāng)含有同源臂的自殺載體導(dǎo)入目的菌株時(shí)，在生存壓力下，自殺載體會(huì)與染色體DNA發(fā)生同源重組，即發(fā)生第一輪單交換，而后在負(fù)篩選的壓力下發(fā)生第二輪的單交換，最終將基因敲除[15]。常見(jiàn)的自殺載體有pK18mob、pCVD442、pSVP202、pKSV7、pEX18Tc等，各種自殺質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)自殺的原理不盡相同，如pCVD442是因?yàn)榇蠖鄶?shù)宿主菌體無(wú)法產(chǎn)生π蛋白。而自殺質(zhì)粒pKSV7同時(shí)也是溫敏型質(zhì)粒。劉武康等[16]利用溫敏型自殺載體pKSV7構(gòu)建重組質(zhì)粒，將單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)這一胞內(nèi)寄生菌的毒力因子內(nèi)化素A(internalinA,InlA)和內(nèi)化素B(internalinB,InlB)基因進(jìn)行敲除，成功研究了雙基因缺失突變菌株的基本生物學(xué)特性。林丹楓等[17]以自殺型質(zhì)粒pSVP202為載體，成功構(gòu)建基因置換質(zhì)粒，敲除類球紅細(xì)菌的八氫番茄素合成基因crtB，并引入大腸埃希菌的4-羥苯甲酸轉(zhuǎn)移酶基因ubiA和分支酸裂解酶基因ubiC，提高了類球紅細(xì)菌中輔酶Q10的產(chǎn)量。韓武洋等[18]利用自殺載體pKB18mobsacB，采用無(wú)抗性標(biāo)記的同源重組法，成功敲除了野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC10332中編碼葡萄糖pts系統(tǒng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ptsG、ptsH、ptsI和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因abc、abc2和ioltl，構(gòu)建了谷氨酸棒狀桿菌葡萄糖代謝阻斷工程菌。

1.4 基于溫敏型質(zhì)粒的同源重組法

溫敏型質(zhì)粒是一種含有溫度敏感型復(fù)制子的質(zhì)粒，它在高溫條件下無(wú)法復(fù)制，在高于37 ℃時(shí)會(huì)自動(dòng)去除。比如常見(jiàn)的用于基因敲除的pKC1139、pKD46、pBV220就是溫敏型質(zhì)粒，pKD46含有oriR101溫度敏感型復(fù)制元。當(dāng)帶有目的菌株同源基因的溫敏型質(zhì)粒進(jìn)入宿主菌株時(shí)，在高溫條件下，溫敏型質(zhì)粒迫于生存的壓力，就會(huì)與宿主染色體上的同源序列發(fā)生同源重組，利用溫敏型質(zhì)粒的這一特性來(lái)對(duì)菌株上的目的基因進(jìn)行敲除，大大提高了成功的概率。四種敲除方法的比較見(jiàn)圖1。段雪梅等[19]利用溫敏型質(zhì)粒pKC1139構(gòu)建重組質(zhì)粒pKT7074，在40 ℃高溫下，迫于生存壓力重組質(zhì)粒pKT7074成功整合到染色體上，取代了靶基因，構(gòu)建出生防菌Act12轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SPA7074缺失突變株。陳暉等[20]以生產(chǎn)氨甲酰卡那霉素B工程菌株黑暗鏈霉菌S.tenebrarius312為出發(fā)菌株，同樣利用溫敏型穿梭質(zhì)粒pKC1139，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBZ2，敲除氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶基因tobZ，得到生產(chǎn)卡那霉素B的工程菌ST314。

1.5 CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除方法

規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一種免疫防御系統(tǒng)，用于抵御外源DNA的入侵[21]，廣泛存在于古細(xì)菌和細(xì)菌中，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)?？梢岳眠@個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除，關(guān)于CRISPR的研究開(kāi)始于1987年，日本研究人員從大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)29 bp、間隔32 bp的重復(fù)序列[22]。這一發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有得到足夠重視，經(jīng)過(guò)十幾年，隨著越來(lái)越多微生物基因組測(cè)序工作的完成，人們發(fā)現(xiàn)在許多細(xì)菌和古細(xì)菌中都存在這樣的重復(fù)序列。2002年荷蘭研究者將這些高度同源的間隔重復(fù)序列命名為CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，并發(fā)現(xiàn)了與CRISPR相關(guān)的基因，即Cas9基因[23-24]。2005年發(fā)現(xiàn)CRISPR間隔序列基因與噬菌體和其他外源DNA序列同源，推測(cè)間隔序列與生物體抵抗外來(lái)入侵有關(guān)[25]，2007年通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了這一猜想，即CRISPR系統(tǒng)具有免疫防御功能[26]。隨后經(jīng)過(guò)許多研究者的不懈努力，CRISPR系統(tǒng)的作用機(jī)制與原理逐步被發(fā)現(xiàn)，并將其應(yīng)用到基因編輯技術(shù)中，在線蟲、人類細(xì)胞、水稻、擬南芥、斑馬魚、果蠅、釀酒酵母等方面都有應(yīng)用。CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)較其他方法具有編輯效率高、靶向性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，當(dāng)然也存在不足的地方，如脫靶效應(yīng)，在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用[27]，同時(shí)也得到越來(lái)越多研究者的重視。

目前根據(jù)Cas9蛋白的不同將CRISPR系統(tǒng)主要分為三種類型，分別為TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ[28],每一類型又分為多種亞型,這從另一方面也說(shuō)明了CRISPR系統(tǒng)的多態(tài)性[29]。TypeⅠ的CRISPR系統(tǒng)在細(xì)菌與古細(xì)菌中都有存在，具有獨(dú)特的Cas3蛋白，在三種類型中最為簡(jiǎn)單的是TypeⅡ的CRISPR系統(tǒng)，但只存在于細(xì)菌中，特有Cas9蛋白，Cas蛋白最少，是進(jìn)行基因編輯時(shí)最常利用的類型,具體結(jié)構(gòu)如圖2。TypeⅢ的CRISPR系統(tǒng)大多在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，少量發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌中，含有功能尚不明確的Cas10蛋白與Cas6蛋白，這三種類型的Cas蛋白在抵御外來(lái)入侵時(shí)各自發(fā)揮著獨(dú)特的功能[30]。CRISPR系統(tǒng)之所以能夠應(yīng)用于基因編輯技術(shù)中，是因?yàn)樗軌蛲ㄟ^(guò)引導(dǎo)RNA特異性切割靶序列。2013年通過(guò)將CRISPR系統(tǒng)應(yīng)用于人類和小鼠胚胎干細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)了多基因的敲除，提高了基因敲除效率[31-32]。

圖2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Fig.2 CRISPR/Cas9 system structure

2 發(fā)明專利

基因打靶技術(shù)應(yīng)用于生物界的所有領(lǐng)域，在動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)方面都有巨大的應(yīng)用價(jià)值?；蚯贸嚓P(guān)研究十分熱門，吸引了很多研究者，得到了許多研究成果及發(fā)明專利，這里對(duì)微生物方面最新相關(guān)專利方法做一介紹。丁承超等[33]發(fā)明了一種敲除減毒單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌兩個(gè)毒力因子actA和inlB的方法，使減毒后的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌作為疫苗的載體，從而研究LM食源性致病菌的致病機(jī)理，該方法的大致步驟：首先設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增出actA基因的上下游片段，然后使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，采用T4DNA連接酶將酶切后的上下游片段連接，同樣使用限制性內(nèi)切酶將連接好的片段與穿梭質(zhì)粒pKSV7再次進(jìn)行酶切，T4DNA連接酶再次連接，最后得到重組質(zhì)粒載體，將其導(dǎo)入大腸埃希菌DH5α中，與此同時(shí)，要將空質(zhì)粒pKSV7導(dǎo)入大腸埃希菌中作為對(duì)照。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌可引起多種疾病，可以穿越血腦、胎盤屏障，對(duì)環(huán)境的耐受能力極強(qiáng)，已引起全世界范圍內(nèi)的關(guān)注，成為基因工程疫苗的研究熱點(diǎn)問(wèn)題，該發(fā)明存在顯著的進(jìn)步性，敲除了單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的兩個(gè)毒力因子，使其減毒，可以作為疫苗載體。王瑞明等[34]發(fā)明了一種地衣芽胞桿菌基因快速敲除的方法，整個(gè)過(guò)程分為四步，首先獲取地衣芽胞桿菌目的基因中一段編碼基因，將其作為同源臂，獲取抗性標(biāo)記基因，這是必不可少的，經(jīng)過(guò)重疊PCR技術(shù)，可以將目的基因同源臂序列和抗性標(biāo)記基因融合在一起，然后進(jìn)行單酶切，最后轉(zhuǎn)化到目的菌株，即感受態(tài)地衣芽胞桿菌，經(jīng)過(guò)一定的培養(yǎng)，得到基因缺失的地衣芽胞桿菌。以前對(duì)地衣芽胞桿菌敲除基因時(shí)，通常是構(gòu)建兩端基因上下游同源臂中間抗性標(biāo)記基因的置換質(zhì)粒，進(jìn)行同源雙交換，這種方法是基于單交換原理，只需進(jìn)行一次同源重組即可，相比較一般的基因敲除技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，周期較短，敲除效率高，存在很大的進(jìn)步意義。劉龍等[35]發(fā)明了一種敲除黑曲霉基因的方法，該方法將基因敲除元件與剪切元件都整合到黑曲霉基因組中，只需進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)下就能消除抗性基因，該發(fā)明提供了新的方法與思路，可以進(jìn)行多個(gè)基因的敲除。于慧敏等[36]利用重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酰胺酶基因缺失紅球菌的感受態(tài)細(xì)胞，得到紅球菌雙基因敲除突變株，公開(kāi)了一種紅球菌雙基因敲除及高表達(dá)腈水解酶的構(gòu)建方法。江福能等[37]利用最近研究較多的CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)發(fā)明了一種miR-205基因敲除試劑盒，此外還有一些基因敲除發(fā)明專利較其他方法都存在顯著優(yōu)點(diǎn)。

3 展 望

基因敲除技術(shù)是一種重要的基因修飾技術(shù)，在各種微生物基因已經(jīng)測(cè)定的條件下，對(duì)各個(gè)基因序列功能的研究就顯得尤為重要，基因敲除技術(shù)為研究基因組的功能提供了可能，通過(guò)對(duì)目的菌株某個(gè)基因的敲除，考察該基因?qū)δ康木甑淖饔谩；蚯贸夹g(shù)的功能在于可以通過(guò)構(gòu)建合適的載體選擇性地修飾基因，進(jìn)而可以控制基因的表達(dá)，了解基因的獨(dú)特功能，進(jìn)一步得到人們所需要的產(chǎn)物?；蚯贸夹g(shù)在改造動(dòng)植物、微生物基因組、研究發(fā)育生物學(xué)、鑒定新基因新功能、育種以及醫(yī)療領(lǐng)域都有應(yīng)用價(jià)值，并取得了很大進(jìn)展，基因敲除技術(shù)為了解基因組的功能提供了有效的工具，為科學(xué)領(lǐng)域的研究帶來(lái)一個(gè)又一個(gè)新的突破，相信在不久的將來(lái)，更多新的基因敲除方法將被發(fā)明，現(xiàn)有方法的不足將得到提高與完善，基因敲除操作將變得越來(lái)越容易。