吳慧昊，牛 鋒，徐紅偉，鐘 琦

(1.西北民族大學(xué) 實驗中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；3.湖北省當陽市動物疫病預(yù)防控制中心，湖北 當陽 444100)

血脂是血漿中三酰甘油、膽固醇等中性脂肪和磷脂、糖脂、固醇、類固醇等類脂的總稱[1]。三酰甘油(Triglyceride，TG)是長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人體內(nèi)含量最多的脂類，大部分組織均可以利用三酰甘油分解產(chǎn)物供給能量。三酰甘油來自食物中脂肪的分解，肝臟也能將血液中的某些糖類轉(zhuǎn)化為三酰甘油。如果三酰甘油過量，囤積于皮下會使身體肥胖，囤積于血管壁則造成動脈硬化，囤積于心臟可引起冠心病、心梗；在大腦，可發(fā)生腦卒中、中風；發(fā)生在眼底，會導(dǎo)致視力下降、失明；如在腎臟，可引起腎衰；發(fā)生在下肢，則出現(xiàn)肢體血流不暢導(dǎo)致壞死[2-3]。此外，三酰甘油高的危害還包括引發(fā)高血壓、膽結(jié)石、胰腺炎；還能夠加重肝炎、致使男性性功能障礙、導(dǎo)致老年癡呆等。目前我國有近1/3的成年人血脂偏高，高脂血癥已成為人類健康的第一隱形殺手。膽固醇(Cholesterol)在人體內(nèi)有著廣泛的生理作用，但當其過量時便會導(dǎo)致高膽固醇血癥，對機體產(chǎn)生不利的影響[4-6]。現(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與高膽固醇血癥有密切的相關(guān)性[7-8]。隨著人們健康意識的增強，減肥降脂迫在眉睫。因此，開發(fā)和利用具有減肥降脂作用，且無毒無害的保健藥品，對保護人體健康具有重要的現(xiàn)實意義。有關(guān)乳酸菌在降膽固醇、降三酰甘油方面的研究，國內(nèi)外有大量的文獻報道和專利成果。如專利CN101864375A植物乳桿菌(C88)、CN102604851A乳酸乳球菌、CN101559082A乳桿菌(MA2)、CN101724589A乳酸菌、CN1186855A屎鏈球菌(DM891129)及鼠李糖乳桿菌(grx10)，但酵母菌在降膽固醇方面的研究鮮見報道，在降三酰甘油方面未見報道[9-13]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采自蘭州黃河啤酒釀造渣，取得樣品后，貯存于無菌容器，低溫運至實驗室，立即分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 麥氏固/液體培養(yǎng)基，油脂培養(yǎng)基，配方參見文獻[14]。高膽固醇MeclaryO-CHOL培養(yǎng)基：準確稱量膽固醇0.1 g放入小燒杯中，加入0.2 g牛膽鹽、0.1 g蔗糖酯、1 mL吐溫-80攪拌均勻，再移取5 mL冰乙酸加熱溶解，把溶解液用超聲波處理15 min后，快速加入到配制好的麥氏液體培養(yǎng)基中，邊加入邊攪拌，使其形成均勻穩(wěn)定的膠體溶液。

1.1.3 試劑與儀器 硫磷鐵顯色劑(三氯化鐵溶液)的配制：稱取5.0 g FeCl3·6H2O溶于200 mL濃磷酸中；磷硫鐵試劑(P-S-Fe試劑)：取40 mL三氯化鐵溶液用濃硫酸定容至500 mL。MLS-3750 全自動高壓滅菌器(JAPAN SANYO)，TU-1900 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，GL-21M 高速冷凍離心機(賽特湘儀離心機儀器有限公司)，BX51T-32P01 數(shù)碼光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CORPORATION.JAPAN)，PB-10 pH儀(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，1285 生物安全柜(Thermo Electron Corporation)，HH.B11.600-BS-II 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離、純化 稱取0.5 g啤酒渣樣品，加入到裝有4.5 mL無菌水試管中，逐次稀釋至10-6，取10-4、10-5、10-6三管稀釋液各0.1 mL，采用涂布法，涂布于麥氏培養(yǎng)基上進行分離，35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取菌落，連續(xù)劃線分離純化，最后選擇單菌落，經(jīng)鏡檢確認為純種后，接種到斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株產(chǎn)脂肪酶效果測定 將分離純化后的菌株在油脂培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)48 h，觀察劃線部分菌落周圍顏色是否變紅，若變紅，則證明菌株可以產(chǎn)脂肪酶分解油脂。

1.2.3 菌株降蛋黃中膽固醇的效果 無菌條件下，于滅菌的培養(yǎng)基中加入一定量雞蛋黃作為膽固醇源，無菌均勻分裝到試管中。以2%(菌體濃度為108cfu/mL)的接種量加入菌液，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液按照磷硫鐵比色法，測定上清液中膽固醇含量[15]。每組實驗設(shè)定5個重復(fù)。膽固醇降低率計算公式：

膽固醇降低率(%)=((C-A)/C)×100%

A：菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液在560 nm處的OD值，C：對照在560 nm處的OD值。

1.2.4 菌株降高純度膽固醇的效果 將菌株以2%(菌體濃度為108cfu/mL)的接種量接種于高膽固醇MeclaryO-CHOL培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液按照磷硫鐵比色法，測定上清液中膽固醇含量。以未接種的高膽固醇MeclaryO-CHOL培養(yǎng)基作對照，計算方法同1.2.3。

1.2.5 菌株對三酰甘油的降解效果 無菌條件下，于滅菌培養(yǎng)基中加入一定量的三酰甘油標準品，無菌分裝到試管中。以2%(菌體濃度為108cfu/mL)接種量加入菌液(未接菌的試管作為空白對照)，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，于420 nm處測定三酰甘油降解率[16]。

三酰甘油降低率(%)=((C-A)/C)×100%

A：菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液在420 nm處的OD值，C：空白對照在420 nm處的OD值。

1.2.6 菌株耐酸性能測定 將菌株活化后制成菌懸液，采用稀釋涂板法測定菌株的濃度。將活化菌株分別接種于pH 6.8、3.0、2.0的麥氏液體培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫培養(yǎng)10 h，利用梯度稀釋平板法測定活菌數(shù)，做5個平行求平均值。以菌株名稱為橫坐標，單位菌落總數(shù)對數(shù)值為縱坐標繪圖。

1.2.7 菌株對0.3%膽鹽環(huán)境的耐受力測定 將菌株活化后制成菌懸液(菌體濃度為108cfu/mL)，按2%的接種量分別接種于含0.0%牛膽鹽(即空白)、0.3%牛膽鹽的復(fù)合液體培養(yǎng)基中。35 ℃培養(yǎng)24 h后，分別測定其OD值，做5個平行求平均值，按下述公式計算菌株對膽鹽的耐受力。

膽鹽耐受力(%)= (含膽鹽培養(yǎng)基的OD/空白培養(yǎng)基的OD)×100%

1.2.8 小鼠體內(nèi)毒性試驗 將20只SPF級昆明雌性小白鼠(8周齡)，隨機分成2組，A組灌胃生理鹽水，B組灌胃解脂亞羅酵母菌懸液。A組小鼠每只每天灌胃生理鹽水0.5 mL，B組小鼠每只每天灌胃含1×108個酵母菌的懸浮液0.5 mL。為了保證菌體溶液中一定的活菌數(shù)，每次灌胃都采用新鮮處理的菌株。自由進水，每周記錄體重。在給藥42 d后，處死解剖，將心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟取出用生理鹽水沖洗并擦拭干凈后稱重，進行器官指數(shù)的測定[17]。此外，觀察器官是否發(fā)生病變。

器官指數(shù)(%)=(器官重量/體重)×100%

1.2.9 菌株生理生化及分子鑒定 分離菌株主要通過繁殖方式觀察、碳源同化試驗、氮源同化試驗、產(chǎn)酸試驗、運動性檢查等生理生化特征進行鑒定。采用26S rDNA法對所分離純化的菌株進行分子鑒定。26S rDNA擴增及序列測定方法參照文獻[18]。聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)產(chǎn)物測序由寶生物工程(大連)有限公司完成。測序完成提交菌株EAM-ZT003T的26S rDNA序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫中進行比對，選取與之相似性最高的10株菌的26S rDNA序列，進行Clustal X比對，MEGA軟件分析，采用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 1 000 次進行穩(wěn)定性驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及純化結(jié)果

分離純化菌株菌落為乳白色，直徑約2 mm，邊緣整齊，容易挑起，鏡檢形態(tài)為卵圓形，出芽生殖，革蘭染色陽性，大小為(1.5～3)μm×(4～5.5)μm。將該菌株命名為EAM-ZT003T(圖1、圖2)。

圖1 酵母菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of yeast strains

圖2 菌株EAM-ZT003T革蘭染色結(jié)果Fig.2 Gram′s staining results of EAM-ZT003T

2.2 菌株EAM-ZT003T產(chǎn)脂肪酶效果測定

將分離純化后的菌株EAM-ZT003T在油脂培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)劃線菌株生長區(qū)域培養(yǎng)基顏色由最初的淡黃色變?yōu)榧t色，由此說明菌株EAM-ZT003T可以產(chǎn)脂肪酶分解油脂(圖3)，活化菌株進行后續(xù)實驗。

2.3 菌株EAM-ZT003T降蛋黃中膽固醇和高純度膽固醇的效果

由圖4可以看出，膽固醇標準曲線擬合后相關(guān)性很好(R2=0.998 9)，可用于待測菌株的降膽固醇能力評價。經(jīng)試驗測得菌株EAM-ZT003T降蛋黃中膽固醇能力為 32.8%，降高純度膽固醇能力為12%(圖5)。

圖3 菌株EAM-ZT003T在油脂培養(yǎng)基上生長情況Fig.3 The growth of the strain EAM-ZT003T on the fat medium

圖4 膽固醇標準曲線Fig.4 Standard curve of cholesterol

圖5 菌株EAM-ZT003T降膽固醇效果Fig.5 Strains by Cholesterol-lowering ability

2.4 菌株EAM-ZT003T對三酰甘油的降解

三酰甘油(TG)是人體內(nèi)含量最多的脂類，三酰甘油高的危害最直接體現(xiàn)在動脈粥樣硬化上。經(jīng)試驗測得菌株EAM-ZT003T對高純度三酰甘油具有非常高的降解能力，其三酰甘油降解率為80.2%，而ZC001、ZC002為實驗室保存的具有降解三酰甘油效果的酵母菌，由圖6可知，菌株EAM-ZT003T對三酰甘油降解效果顯著高于菌株ZC001、ZC002。

圖6 菌株EAM-ZT003T對三酰甘油的降解能力Fig.6 Strains by Triglyceride-lowering ability

2.5 菌株EAM-ZT003T耐酸結(jié)果

菌株應(yīng)用于食品或藥品制備，必須具有較好的耐酸性和在酸性環(huán)境中生長發(fā)育的特性，才能在胃和小腸前段存活。菌株EAM-ZT003T在pH 6.8(正常培養(yǎng)基pH值)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h，菌株活菌數(shù)為107cfu/mL，在pH 3.0的條件下活菌數(shù)也可達107cfu/mL，在pH 2.0時，培養(yǎng)10 h，菌株的存活率有所下降，但仍能達到105cfu/mL(圖7)。耐酸實驗表明，菌株EAM-ZT003T具有較強的耐酸性，對酸性環(huán)境的適應(yīng)性都比較好，若進入人體腸道后，還能存活較多，不會影響降膽固醇降三酰甘油活性。

圖7 菌株EAM-ZT003T耐酸試驗Fig.7 Effects of different acidity on the growth of strains

2.6 菌株EAM-ZT003T對0.3%膽鹽環(huán)境耐受力

當菌株進入口腔，經(jīng)過胃和小腸，最終到達小腸末端，人體小腸中膽鹽含量在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動，因此要求益生菌株不僅能耐受一定的酸度還能有一定的膽鹽耐受力。實驗選取人體小腸中膽鹽最大濃度進行測定。經(jīng)試驗測得菌株EAM-ZT003T在含0.3%牛膽鹽的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，膽鹽耐受能力為91.7%；菌株ZC001、ZC002膽鹽耐受力分別為78.0%、42.7%，由圖8可知，菌株EAM-ZT003T膽鹽耐受力強于菌株ZC001、ZC002，具有很強的耐膽鹽能力。

圖8 膽鹽耐受試驗Fig.8 Tolerance of the strains to bile salts

2.7 毒性試驗結(jié)果

毒性試驗各組小鼠毛色光潔，食欲正常，灌胃42 d未出現(xiàn)異常體征，未發(fā)現(xiàn)異常死亡，小鼠體重增長前14 d較快，14 d后趨于平穩(wěn)，但試驗過程中未出現(xiàn)消瘦、異常死亡現(xiàn)象(圖9)。小鼠解剖后內(nèi)臟正常，顏色紅潤、光滑，小鼠器官無氣質(zhì)性改變，喂菌小鼠與對照組小鼠器官指數(shù)差異不顯著(P<0.05)，說明不同實驗處理對小鼠肝臟、腎臟、心臟、脾臟和肺臟并未產(chǎn)生影響(見表1)。結(jié)果表明飼喂菌株EAM-ZT003T對小鼠沒有毒副作用。

圖9 毒性試驗小鼠體重變化Fig.9 The body weight of mice

表1 毒性試驗小鼠器官指數(shù)比較Table 1 he viscera indices of mice

2.8 菌株EAM-ZT003T生理生化及分子鑒定結(jié)果

菌株經(jīng)半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，菌株沿穿刺線生長，邊緣清晰，無運動性。菌株不能液化明膠，不還原硝酸鹽，具體生理生化鑒定結(jié)果見表2。

表2 菌株EAM-ZT003T生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological identification results

續(xù)表2

注：“+”代表陽性反應(yīng)；“-”代表陰性反應(yīng)

2.9 菌株EAM-ZT003T分子鑒定結(jié)果

測序完成提交菌株EAM-ZT003T的26S rDNA序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株EAM-ZT003T的基因序列，在所有相似的序列中，與解脂亞羅酵母菌株(Yarrowialipolytica)的同源性為 100%，使用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖10)。結(jié)果顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹上菌株EAM-ZT003T與YarrowialipolyticaNRRL YB-423在發(fā)育樹上聚為一簇，具有較近的進化距離。因此結(jié)合生理生化特征，將分離的菌株EAM-ZT003T鑒定為解脂亞羅酵母菌，命名為Y.lipolyticaZT003T。

圖10 依據(jù)26S rDNA序列構(gòu)建的菌株EAM-ZT003T與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 Phylogenetic tree of strain EAM-ZT003T and related strains based on 26S rDNA

3 討 論

本研究從啤酒渣中分離純化出1株酵母菌，經(jīng)生理生化及26S rDNA鑒定為解脂亞羅酵母菌(Y.lipolytica)。該菌株具有極好的降膽固醇(TC)、降三酰甘油(TG)的功效，尤其降三酰甘油(TG)能力高達80.2%，如此高的降三酰甘油能力在中外文獻中還未見報道，有關(guān)菌株在降膽固醇降三酰甘油方面的研究，基本集中于乳酸菌的研究，而酵母菌在此方面的研究鮮見報道。

菌株要在宿主胃腸道中生存并發(fā)揮作用必須具備抗酸和耐膽鹽的能力[19]。胃中的酸環(huán)境隨飲食結(jié)構(gòu)不同而發(fā)生較大的變化[20]。一般來說，空腹時胃液的pH為0.9～1.8，進食過程中pH為1.8～5.0，通常維持在3.0左右[21]。一般認為，菌株能在pH 3.0的條件下存活 2 h并能耐受0.1%膽鹽的益生菌就能順利通過胃和上段腸管而到達下段腸管放大其生物學(xué)功效[22]。菌株EAM-ZT003T具有非常好的耐酸、耐膽鹽性能，進入人體胃腸道后，有較多的活菌存在，可確保菌株的降膽固醇降三酰甘油活性，經(jīng)動物體內(nèi)毒性實驗發(fā)現(xiàn)，菌株無毒副反應(yīng)。因此，菌株EAM-ZT003T可用于新型降脂降膽固醇保健藥品及功能食品的制備。菌株降脂降膽固醇作用機制，具體是由菌株自體吸收，還是產(chǎn)生相關(guān)酶類分解脂類物質(zhì)，或是通過調(diào)節(jié)脂類在肝臟和腸道的關(guān)鍵機制來調(diào)控脂類物質(zhì)的合成吸收和代謝[23-26]，以及菌株的動物體內(nèi)降脂試驗將在后期研究中完成。