鄒 敏，宮 曉，張 青，楊旭兵，于可超，劉 東，劉 蕾，李陸梅，劉擁軍，范根成

（青島易邦生物工程有限公司，動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266144）

豬瘟又稱古典豬瘟（classical swine fever，CSF），是由古典豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）感染豬而引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，臨床以高熱、沉郁、多器官出血、高死亡率為特征，具有高傳染性和致死性[1]。該病的易感動(dòng)物為家豬和野豬，發(fā)病無(wú)季節(jié)性特點(diǎn)，是影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重大豬病之一，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的必須報(bào)告動(dòng)物傳染病，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的一類動(dòng)物疫病，是《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020 年）》中明確的優(yōu)先防治病種[2-4]。

CSFV 歸屬于黃病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒屬（Pestivirus），是單股正鏈RNA 病毒，基因組全長(zhǎng)約12 kb，其基因組兩端分別為5′NTR 和3′NTR，有4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因C、E0、E1、E2，其 余8 個(gè) 基 因（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）為非結(jié)構(gòu)蛋白基因[5-7]。國(guó)內(nèi)外已有研究表明，CSFV 只有1 個(gè)血清型，依據(jù)E2 基因主要抗原區(qū)域（190 bp，以下簡(jiǎn)稱E2 基因）或E2基因全長(zhǎng)（1 119 bp）將其分為3個(gè)基因型（1、2、3）、11 個(gè) 亞 型（1.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3、3.4），其中2.1 亞型又可進(jìn)一步分為2.1a、2.1b、2.1c 和2.1d 共4 個(gè)分支[8-9]。我國(guó)豬群中存在1、2 兩種基因型CSFV 毒株。1型CSFV 主要是1.1 亞型；2 型CSFV 依據(jù)序列特點(diǎn)分為3 種（2.1、2.2、2.3）基因亞型，尤以2.1亞型為優(yōu)勢(shì)毒株，且以2.1b 分支毒株為主，近年來(lái)又出現(xiàn)了2.1d 分支毒株[10-11]。我國(guó)自2007 年以來(lái)對(duì)豬瘟實(shí)施強(qiáng)制免疫政策，并取得較好的防治效果[12]。山東是我國(guó)養(yǎng)豬大省。為了解該省豬群中的CSFV 感染情況及其分子特點(diǎn)，開(kāi)展了為期7 年的CSFV 分子流行病學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 組織樣品

共79 份，由本公司技術(shù)服務(wù)部收集、提供，已經(jīng)研磨、提取核酸、RT-PCR 檢測(cè)，確定為CSFV 核酸陽(yáng)性。2012—2018 年收集的樣品數(shù)分別為12、10、14、13、10、10、10 份，均已研磨為混懸液，分裝規(guī)格為2 mL/管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因擴(kuò)增引物

參考朱小甫等[13]設(shè)計(jì)的E2 基因引物，將序列發(fā)送上海生工進(jìn)行合成，收到引物后用DEPC 水稀釋至20 pmol/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

TRIzol LS Reagent，購(gòu)自Invitrogen；一步法RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)物（DL2000），購(gòu)自TaKaRa；DNA 純化試劑盒，購(gòu)自天根生物；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；瓊脂糖、無(wú)RNA/DNA 酶DEPC 水，購(gòu)自上海生工。

1.4 核酸提取

取1.1 節(jié)保存的79 份組織處理混懸液于臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中進(jìn)行12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min；每份樣品取上清液250 μL，按照TRIzol LS Reagent 使用說(shuō)明，提取總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 E2 基因RT-PCR 擴(kuò)增

擴(kuò)增總體系50 μL，分別包含：預(yù)混酶（enzyme mix）2 μL、2×buffer 25 μL、E2 基因擴(kuò)增引物對(duì)各1 μL、總RNA 5 μL、DEPC 水16 μL。瞬時(shí)配制好反應(yīng)體系后放入預(yù)先開(kāi)啟、設(shè)置好程序的PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 30 min、94 ℃ 5 min，然后進(jìn)入35 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)94 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，最后72 ℃延伸8 min。反應(yīng)終止后，取適量PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢查，并拍照。

1.6 基因測(cè)序及編輯

將電泳檢測(cè)后的剩余PCR 產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，收到結(jié)果后用DNAstar（Version 7.10）軟件中的Editseq，對(duì)序列進(jìn)行校對(duì)，截取190 bp 用于分析[14-16]。

1.7 E2 基因序列分析

利用DNAstar 中的Megalign，對(duì)59 個(gè)不同年份的CSFV E2 基因序列與28 個(gè)不同基因亞型CSFV 參考毒株E2 基因同一區(qū)域、以及7 個(gè)分離自山東省的CSFV毒株（表1）E2基因進(jìn)行序列分析。

表1 基因1、2、3 型CSFV 參考毒株背景信息

1.8 遺傳發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析

配合使用Megalign、Clustal X 1.83 兩個(gè)軟件，對(duì)測(cè)定的59 個(gè)CSFV、35 個(gè)參考CSFV 的E2 基因進(jìn)行聚類分析，再使用MEGA 6 軟件，采用鄰接法構(gòu)建基于CSFV E2 基因（190 bp）的進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 E2 基因擴(kuò)增及測(cè)序

對(duì)79 份CSFV 陽(yáng)性樣品進(jìn)行CSFV E2 基因擴(kuò)增，共獲得59 個(gè)CSFV E2 基因陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，送樣測(cè)序正確，經(jīng)編輯、截取190 bp 的片段用于分析，其中23 份樣品的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)下圖1。

圖1 病料中CSFV 的檢測(cè)結(jié)果

2.2 E2 基因核苷酸序列同源性分析

SDQDF1-12、SDQW9-12、SDQDF5-12、SDJM-17、SD254-18、SD265-18、SD267-18 與Shimen 等 基 因1 型CSFV 參 考 毒 株、Alfort 等基 因2 型CSFV 參 考 毒 株、YI9908 等 基 因3 型CSFV 參考毒株的E2 基因同一編碼區(qū)（以下簡(jiǎn)稱為E2 基因）堿基序列同源性介于84.1%～99.5%、79.9%～85.7%、82.0%～86.2%。SDJZ-15 與上述3 種基因型CSFV 參考毒株的E2 基因堿基序列同源性介 于81%～90.5%、87.3%～96.8%、85.7%～90.5%。其他51 個(gè)CSFV 測(cè)序毒株與上述3 種基因型CSFV 參考毒株E2 基因堿基序列同源性介于77.2%～85.7%、81.5%～96.8%、75.7%～82.5%。59 個(gè)測(cè)序毒株之間的E2 基因序列同源性介于79.4%～100%。

2.3 E2 基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性分析

SDQDF1-12、SDQW9-12、SDQDF5-12、SDJM-17、SD254-18、SD265-18、SD267-18 與Shimen 等基因1 型CSFV 參考毒株、Alfort 等基因2 型CSFV 參考毒株、YI9908 等基因3 型CSFV參考毒株E2 基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別介于79.4%～100%、82.5%～96.8%、79.4%～88.9%。SDJZ-15 與 上 述3 種CSFV 參 考 毒 株E2 基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性介于81%～90.5%、87.3%～96.8%、85.7%～90.5%。 其 他51 個(gè)CSFV測(cè)序毒株與上述3 種基因型CSFV 參考毒株E2基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性介于79.4%～93.7%、84.1%～100%、81%～93.7%。59 個(gè)測(cè)序毒株之間的E2 基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性介于81.0%～100%。

對(duì)全部59 個(gè)測(cè)序毒株與參考毒株的E2 基因28～90 位aa 序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SDQDF1-12、SDQW9-12、SDQDF5-12、SDJM-17、SD254-18、SD265-18、SD267-18 與1.1 亞群代表Shimen、C株的E2 基因28～90 aa 未發(fā)生變異，與我國(guó)的疫苗株C 株相比，7 個(gè)毒株中有3 個(gè)毒株的E2 基因aa序列與C 株一致，提示這7 個(gè)毒株可能起源于疫苗毒或?yàn)轭愐呙缍局辏▓D2）。SDJZ-15 株 E2 基因與2.1b 亞型毒株E2 基因的28～90 aa 序列基本一致，僅A51突變?yōu)閂51（圖3）。其他51 個(gè)測(cè)序毒株與基因2 型毒株E2 基因的28～90 aa 序列基本保持一致，多數(shù)毒株K32突變?yōu)镽32/E32，N35突變?yōu)镾35，A51突變?yōu)镾51，T57突變?yōu)镮57（圖4）。

圖2 7 個(gè)1.1 亞群毒株E2 基因推導(dǎo)氨基酸序列變異比較

圖3 SDJZ-15 與2.1b 亞群毒株E2 基因推導(dǎo)氨基酸序列變異比較

2.4 CSFV 遺傳發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

將59 個(gè)測(cè)序毒株的E2 基因序列與35 個(gè)國(guó)內(nèi)外CSFV 參考毒株E2 基因進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建遺傳發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖5），發(fā)現(xiàn)SDQDF1-12、SDQW9-12、SDQDF5-12、SDJM-17、SD254-18、SD265-18、SD267-18 與Shimen 株等歸屬于1.1 亞群，SDJZ-15 與參考毒株CSF0708 等歸屬于2.1b亞群，其他51 個(gè)毒株則屬于2.1d 亞群。

3 討論

圖4 51 個(gè)測(cè)序毒株與2.1d 亞群毒株E2 基因推導(dǎo)氨基酸序列變異比較

用于CSFV 基因分型的靶基因包括5' NTR、E2 基因（190 bp）、NS5B 基因，但國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最多的是E2 基因。Lowings 等[17]對(duì)1945—1994 年獲得的14 個(gè)國(guó)家的115 個(gè)CSFV 毒株進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這115 個(gè)毒株分別屬于1.1、1.2、2.1、2.2、2.3 共5 個(gè)CSFV 亞型。2013 年，Postel 等[11]在古巴發(fā)現(xiàn)1.4 亞型毒株；Pereda 等[18]在危地馬拉和洪都拉斯發(fā)現(xiàn)1.3 亞型毒株；基因3 型毒株主要出現(xiàn)在我國(guó)臺(tái)灣、日本、韓國(guó)等亞洲地區(qū)[10，19-20]。在國(guó)內(nèi)，王琴等[21]對(duì)12 株CSFV 進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)20 世紀(jì)80—90 年代的CSFV 主要是1 型、2 型。趙耘等[22]對(duì)l7 株CSFV 的 E2 基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這些毒株分別歸屬于1.1、2.1、2.2 亞群，但以1.1 亞型毒株為主。吳健敏等[23]對(duì)廣西地區(qū)13 株CSFV 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些毒株分屬于1.1、2.1、2.2 和2.3。涂長(zhǎng)春等[24]對(duì)來(lái)自30 個(gè)省份的191 株CSFV E2 基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)50 個(gè)毒株屬1.1 亞型、76 個(gè)毒株屬2.1 亞型、51 個(gè)毒株屬2.2亞型、13 個(gè)毒株屬2.3 亞型，提示我國(guó)的CSFV流行毒株以2.1 亞型為主。王博陽(yáng)等[25]、Deng等[26]、Zhang 等[27]的研究顯示，我國(guó)各地流行的2.1 亞型CSFV 毒株又可分為2.1a、2.1b、2.1c、2.1d 共4 個(gè)分支。

圖5 基于CSFV E2 基因主要抗原區(qū)域構(gòu)建的遺傳發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

我國(guó)研制的豬瘟兔化弱毒疫苗免疫效果極佳，經(jīng)數(shù)十年應(yīng)用，特別自2007 年實(shí)行強(qiáng)制免疫政策以來(lái)，我國(guó)的豬瘟疫情得到了有效控制，但并未根除[28-29]。CSFV 為單鏈RNA 病毒，在長(zhǎng)期的疫苗免疫壓力下，田間CSFV 將進(jìn)一步發(fā)生變異。研究顯示，我國(guó)豬群中的CSFV 流行株已從1.1 亞型毒株逐漸演化到1.1 亞型、2.1 亞型混雜存在，并以2.1 亞型為優(yōu)勢(shì)毒株。山東作為國(guó)內(nèi)生豬存欄量居前列的大省，相關(guān)地市豬群中CSFV 毒株的分子特點(diǎn)也與其他省份極為類似[30]。因此，為掌握山東省豬群中CSFV 的遺傳演化特點(diǎn)，從而為有效防控該病提供數(shù)據(jù)支持，對(duì)2012 年以來(lái)收集的、經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)為CSFV 核酸陽(yáng)性的臨床樣品直接進(jìn)行了E2 基因測(cè)序及分子流行病學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)研究結(jié)果與馮麗蘋(píng)等[31]所發(fā)表的研究結(jié)果基本一致，除發(fā)現(xiàn)1 株2.1b 亞型毒株、7 株1.1 型毒株外，其余51 株均為2.1d 亞型，表明現(xiàn)階段山東省內(nèi)豬群中的CSFV 優(yōu)勢(shì)毒株的基因型為2.1d。這提示需要對(duì)本病總體流行態(tài)勢(shì)、病毒遺傳演化特點(diǎn)以及現(xiàn)有疫苗免疫效果進(jìn)行跟蹤研究，以便有效控制該病，保障生豬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。