王海燕，謝 靜，王 濤，劉 靜，管遠(yuǎn)紅，張 斌，徐亞亞，曹明鳳，崔樂遙，劉宗平

（1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

犬細(xì)小病毒（canine parvovirus，CPV）能導(dǎo)致犬和其他食肉動物發(fā)生急性出血性腸炎、白細(xì)胞減少癥、幼犬致死性心肌炎以及惡心、嘔吐等[1]。該病毒屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬[2]，與貓泛白細(xì)胞減少癥病原（feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV）密切相關(guān)。由于先發(fā)現(xiàn)的犬微小病毒（canine minute virus）已被稱為CPV，為了與其區(qū)別就將該病毒命名為CPV-2。由于犬微小病毒多無致病性，已被列入牛犬病毒屬，因此現(xiàn)CPV 多指犬細(xì)小病毒[2]。

CPV 是目前動物病毒中最小、最簡單的一類線狀單股DNA 病毒，全長約5 323 nt，無囊膜，直徑約260 ?，二十面體對稱。CPV 的完整核衣殼由60 個拷貝的VP1、VP2 和VP3 蛋白組裝而成，其中包括5～6 拷貝的VP1 和VP3，以及53～54 拷貝的VP2，其中VP2 是CPV 核衣殼的主要構(gòu)成蛋白，具有抗原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體[3]。

發(fā)現(xiàn)該病后，疫苗很快就被應(yīng)用到臨床上，主要以最初的CPV-2 型作為疫苗株。隨著使用時間的推移，疫苗的免疫效果出現(xiàn)了明顯下降。研究發(fā)現(xiàn)，該病毒出現(xiàn)了抗原漂變，從而引發(fā)了對CPV 基因的研究[3]。CPV 變異速度很快，幾乎與某些RNA 病毒相似，每個核苷酸每年出現(xiàn)約10-4的變異率[4]。CPV-2 型被確認(rèn)后不久，1979—1981 年多個國家出現(xiàn)了CPV-2a 變異株[5]，1986年第2 個抗原變異型CPV-2b 被發(fā)現(xiàn)[6]，2001 年意大利報道了另一個新的變異型CPV-2c 亞型[7]。近期的一些研究表明，CPV-2c 型已經(jīng)存在于很多國家，包括越南[8]、美國[9]、西班牙[10]、烏拉圭[11]和印度[12]，這就逐漸驗(yàn)證了CPV-2c 將在全球范圍內(nèi)流行的猜想[13-15]。另外我國也出現(xiàn)了CPV-2c的相關(guān)報道，表明目前在我國CPV-2c 型正與其他亞型共同流行[13]。CPV 由于核苷酸的突變形成了不同的基因型，而基因突變造成了抗原漂變，抗原漂變又引起了疫苗免疫效果的下降，甚至免疫失敗。為了解江蘇省揚(yáng)泰地區(qū)的CPV 分子特征和基因型，通過病原分離和鑒定，開展了分子流行病學(xué)調(diào)查，以期為今后該病防控打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料

2015 年10 月—2016 年12 月，在揚(yáng)州和泰州地區(qū)寵物醫(yī)院，對臨床表現(xiàn)有血樣腹瀉、體溫升高、嘔吐和脫水等癥狀，經(jīng)膠體金試紙條檢測為陽性或弱陽性的病犬進(jìn)行病例信息收集，并采集泄殖腔棉拭子或糞便作為檢測樣品，記錄所采樣品的流行病學(xué)資料，-20 ℃冷凍保存。標(biāo)準(zhǔn)參考株，來自揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

10% DMEM（ 小 牛 血 清） 營 養(yǎng) 液、1%DMEM（ 小 牛 血 清） 維 持 液、 無 抗 無 血 清DMEM、PBS 和1% PE（胰酶）：均按常規(guī)方法配制。Taq DNA 聚合酶、200 bp DNA Ladder Marker 等：購自Fermentas 有限公司；Biowest Agarose：購自上海美季生物技術(shù)有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）：購自Sigma 公司。其他常規(guī)試劑，均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

臺式高速離心機(jī)（TGL-16 型）：上海醫(yī)用分析儀器廠產(chǎn)品；PCR 儀（Bio-Rad S1000 型）和BIO-RAD3000XI 型電泳儀：美國BIO-RAD 公司產(chǎn)品；UV-2000 紫外分析儀：天能科技（上海）有限公司產(chǎn)品；50 mL 細(xì)胞培養(yǎng)瓶：江蘇江陰三寶玻璃細(xì)胞培養(yǎng)瓶廠產(chǎn)品；20 μL 及200 μL 移液器：法國Gilson 公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 樣品預(yù)處理和病毒分離

將樣品用含有雙抗（青鏈霉素）的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2）按照1:9 的比例稀釋，并置于4 ℃過夜；接著8 000 r/min 離心10 min；取上清液，使用一次性微量過濾器（0.22 μm）過濾，然后接種于貓腎細(xì)胞系（FK81）并觀察病變，盲傳3代；將第3 代細(xì)胞毒，按照常規(guī)方法進(jìn)行豬血血凝（hemagglutinin，HA）試驗(yàn)。

2.2 酚氯仿法抽提PCR 反應(yīng)的DNA 模板

將疑似CPV 感染的樣本分別接種FK81細(xì)胞，連傳3 代，然后收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，用EasyPure?Viral DNA/RNA Kit 試 劑 盒 抽 提 病 毒DNA，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PCR 擴(kuò)增和序列分析

基因擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[7]合成，序列見表1。將PCR 產(chǎn)物被送往上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，使用DNAstar 軟件（Version 7.1.0）進(jìn)行序列比對。

表1 CPV 基因分型引物

首先使用引物Pab 對樣品進(jìn)行分型，如果Pab擴(kuò)增結(jié)果為陽性，再使用引物Pb 確定CPV-2b 亞型。如果Pb 擴(kuò)增后的結(jié)果為陰性，就證實(shí)此樣品毒株屬于CPV-2a 亞型；如果結(jié)果為陽性，則屬于CPV-2b 或2c 亞型，再根據(jù)測序突變與否，確定具體為何種亞型。

3 結(jié)果

3.1 病毒分離及HA 試驗(yàn)

樣品接種約72 h 后，在FK81 細(xì)胞上形成典型的拉網(wǎng)狀病變（圖1-B）。接過毒的絕大多數(shù)細(xì)胞均發(fā)生腫脹、變圓以及脫落。共獲得了48 個分離株。

HA 試驗(yàn)結(jié)果表明，盲傳3 代后的病毒滴度在1:64～1:256 之間。

3.2 PCR 擴(kuò)增

Pab 引物和Pb 引物PCR 擴(kuò)增結(jié)果見圖2、圖3。根據(jù)PCR 結(jié)果可知，48 株病毒中，有4 株CPV-2、24 株CPV-2a（表2）。對剩余20 株進(jìn)一步測序，以確定具體亞型。

3.3 427 bp 片段基因序列比對分析和基因型確定

經(jīng)測序，發(fā)現(xiàn)剩余的20 株毒株均為CPV-2b型。核酸序列比對發(fā)現(xiàn)，該基因型在426 位（根據(jù)CPV-b，M38245 的核酸序列）沒有出現(xiàn)G 到A的突變，也就是說在氨基酸殘基426 位沒有出現(xiàn)Asn/Asp426Glu 的突變，未發(fā)現(xiàn)CPV-2c 型突變株。最終確定的基因型見表3。

圖2 樣品Pab 引物PCR 擴(kuò)增結(jié)果

4 討論

圖3 樣品Pb 引物的PCR 擴(kuò)增結(jié)果結(jié)果

表2 4 株CPV-2、24 株CPV-2a 分離株來源

表3 測序的20 株P(guān)CV 分離株來源與亞型

CPV 突變速率很高，與一些RNA 病毒一樣，短期內(nèi)可形成多種變異株[3-5]，造成臨床上疫苗免疫失效。鑒于對家養(yǎng)犬類和一些野生食肉動物健康的潛在威脅，人們對該病毒的變異情況越來越重視[15]。在各個國家和地區(qū)中，CPV 不同變異株所占的比例不盡相同[8-12]。我國犬類中，該病毒感染率很高，各種基因型均有，但有一定的地域差別[13]。

本研究對揚(yáng)州、泰州地區(qū)采集到疑似CPV 感染的48 份樣品進(jìn)行了毒株分離鑒定與分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CPV-2a 和CPV-2b 亞型的比例高，這與報道的CPV-2a 占主導(dǎo)地位的報道有很大的不同[14]。引起這個不同的原因可能有兩點(diǎn)：第一，在強(qiáng)大的選擇壓力之下，我國的CPV-2a 亞型變異株正在不斷地向CPV-2b 亞型進(jìn)化；第二，揚(yáng)州、泰州地區(qū)的CPV 變異株分布與北京地區(qū)本身就存在非常大的差異。本研究將分離株序列與Genbank 上發(fā)表的序列比較后發(fā)現(xiàn)了一些氨基酸殘基的非同義替換。這些替換對CPV 生物學(xué)特性的影響還有待進(jìn)一步研究。盡管在這次的揚(yáng)州、泰州地區(qū)CPV 分子流行病學(xué)調(diào)查中并未發(fā)現(xiàn)CPV-2c，但因采集樣品有限，仍不能排除CPV-2c 在該地區(qū)的存在。

目前使用的大多數(shù)疫苗都是基于最原始的1979—1981 年分離的CPV-2 型病毒的弱毒苗[16]。該疫苗在控制CPV 傳播流行方面起到了重要作用[17]。而最新抗原型弱毒疫苗，能產(chǎn)生更為全面的保護(hù)力[16]。Decaro 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CPV-2c 感染犬所表現(xiàn)的臨床癥狀往往較輕，引起的動物死亡率也比CPV-2a/CPV-2b型要低的多。然而在本研究中，鑒定為CPV-2b陽性樣品來源犬的癥狀也都比較輕，甚至與一些報道的CPV-2c 引起的癥狀相一致，推測這可能是因?yàn)槭褂玫钠渌蛐鸵呙缫伯a(chǎn)生了一定的交叉保護(hù)。

5 結(jié)論

綜 上 所 述，2015 年5 月 至2016 年12 月，CPV-2a 型與CPV-2b 型在揚(yáng)州、泰州地區(qū)占據(jù)了優(yōu)勢。疫苗的廣泛使用導(dǎo)致犬感染后的臨床表現(xiàn)并不嚴(yán)重，但新基因型毒株仍能造成一定的發(fā)病率和病死率，威脅著犬的健康，因此需開展深入研究來防控該病。