王瑩，王華，趙麗，李嶼君

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物藥學(xué)院，江蘇泰州225300；2.南京理工大學(xué)泰州科技學(xué)院藥學(xué)院，江蘇泰州225300）

麥冬為多年常青草本植物，生長(zhǎng)在溫暖濕潤(rùn)的地方，主要分布在廣東、廣西、福建、臺(tái)灣、浙江、江蘇等地。麥冬作為養(yǎng)陰潤(rùn)肺的上品，不僅具有抗疲勞、清除自由基，提高細(xì)胞免疫功能以及降血糖的作用，還具有催眠、抗心律失常、促進(jìn)胰島細(xì)胞功能恢復(fù)等作用。麥冬的主要化學(xué)成分有甾體皂苷、多糖、氨基酸等[1-2]。麥冬多糖作為麥冬的主要活性成分之一，具有耐缺氧、降血糖、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[3-9]。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道，麥冬多糖對(duì)四氧嘧啶所致糖尿病小鼠有降血糖作用并能改善小鼠的耐糖力，并且可提高長(zhǎng)期負(fù)荷訓(xùn)練大鼠的免疫功能，抑制過(guò)氧化損傷和糖原的耗竭，具有良好的開(kāi)發(fā)前景[10-11]。由此可見(jiàn)，尋找一種經(jīng)濟(jì)合適的麥冬多糖的提取方法至關(guān)重要。目前，已有學(xué)者采用水提醇沉法提取多糖，利用響應(yīng)曲面法和正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化襄麥冬多糖和山麥冬多糖的工藝參數(shù)[12-13]，但鮮有采用二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化廣東麥冬多糖的提取工藝以及抗氧化能力的報(bào)道。本文以廣東麥冬為原料，采用水提醇沉法提取多糖，以苯酚-硫酸法測(cè)定提取物中多糖的含量，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，并研究麥冬多糖的抗氧化活性，為廣東麥冬多糖的開(kāi)發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：產(chǎn)自廣東省經(jīng)炮制過(guò)的麥冬原料，60 ℃下真空干燥，經(jīng)多功能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)20 目篩，所得麥冬粉末密封貯藏，備用。

葡萄糖對(duì)照品、苯酚（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）：無(wú)錫靈達(dá)化工有限公司；硫酸（分析純）：無(wú)錫市佳妮化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HK-02A 多功能粉碎機(jī)：上海燁昌食品機(jī)械有限公司；HH-1 數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；UV-1800PC-DS2 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；DZF-6050 真空干燥箱：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵：河南省予華儀器有限公司；LE204E 電子天平：梅特勒-托利多有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取葡萄糖對(duì)照品13.2 mg，加蒸餾水溶解，定容至 25 mL，精密吸取 0.00（空白）、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 上述溶液于10 mL 容量瓶中，分別加1 mL 5%苯酚水溶液，5 mL 濃硫酸，蒸餾水定容至刻度線，混合均勻，20 ℃放置30 min，在490 nm 處測(cè)定吸光度[14]，以吸光度值對(duì)葡萄糖溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.3.2 麥冬多糖的提取及測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g 干燥的麥冬粉末于250 mL 燒杯中，按照一定的液料比加入蒸餾水，熱水浸提，抽濾，收集濾液，將濾液濃縮至10 mL 后加入足量95%乙醇，靜置，待多糖全部沉降，抽濾，濾餅經(jīng)真空干燥即得麥冬多糖。

將麥冬多糖用適量蒸餾水溶解后定容至250 mL，準(zhǔn)確移取1.00 mL 多糖溶液于250 mL 容量瓶中，加入5%苯酚水溶液1 mL、濃硫酸5 mL，定容，搖勻后放置30 min，在490 nm 處測(cè)定吸光度，通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析計(jì)算，從而得出麥冬多糖得率。

式中：m 為麥冬粉末的質(zhì)量，mg；A490為稀釋后的多糖溶液的吸光度；前一個(gè)250 為稀釋倍數(shù)；后一個(gè)250 為麥冬多糖溶液體積，mL。

1.3.3 麥冬多糖的抗氧化性作用試驗(yàn)

取適量干燥的麥冬多糖，配制 20、40、60、80、100、120 mg/L 麥冬多糖水溶液，備用。

采用DPPH 法[15-18]，準(zhǔn)確移取0.20 mL 不同濃度的麥冬多糖提取液于比色管中，加入預(yù)先配置好的4 mL 0.15 mmol/L 的DPPH 甲醇溶液，搖勻后暗處放置30 min，以樣品溶劑為空白，測(cè)定其在515 nm 波長(zhǎng)處吸光度A，同時(shí)測(cè)定樣品溶液在515 nm 處的吸光度A0及DPPH 甲醇溶液在515 nm 處的吸光度A1，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)麥冬多糖得率的影響

稱(chēng)取5 份質(zhì)量為10 g 的麥冬粉末，按液料比為4 ∶1、6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1（mL/g）加入蒸餾水，70 ℃水浴浸提1.5 h，濾液濃縮至10 mL，加入50 mL 95%乙醇進(jìn)行醇沉，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of ratios of water to materials on extraction yield of polysaccharides

由圖2 可知，當(dāng)液料比在 4 ∶1（mL/g）～8 ∶1（mL/g）范圍內(nèi)時(shí)，隨著溶劑體積的增大，麥冬多糖的得率顯著上升；溶劑體積繼續(xù)增大時(shí)，麥冬多糖得率趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)檎麴s水用量越大，水中麥冬多糖濃度相對(duì)就越低，麥冬細(xì)胞內(nèi)外多糖濃度差越大，傳質(zhì)推動(dòng)力越大，麥冬多糖就越容易浸出[19]。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)麥冬多糖得率的影響

稱(chēng)取5 份質(zhì)量為10 g 的麥冬粉末，按液料比8 ∶1（mL/g）加入蒸餾水，置于 70 ℃的恒溫水浴鍋中分別浸提 0.5、1、1.5、2、2.5 h，醇沉?xí)r加入 50 mL 95%乙醇，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of time on extraction yield of polysaccharides

由圖3 可知，隨著提取時(shí)間的增多，多糖的得率逐步升高，這是由于當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，多糖還未充分提取出來(lái)，當(dāng)提取時(shí)間為2 h 時(shí)，多糖得率最高，繼續(xù)提取，多糖得率幾乎不變。

2.1.3 乙醇用量對(duì)麥冬多糖得率的影響

分別稱(chēng)取5 份質(zhì)量為10 g 的麥冬粉末，按液料比8 ∶1（mL/g）加入蒸餾水，置于 70 ℃的恒溫水浴鍋中浸提 1.5 h，醇沉?xí)r分別加入 40、50、60、70、80 mL 95%乙醇，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 乙醇用量對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of ethanol content of the yield of polysaccharides

由圖4 可知，隨著乙醇用量的增多，麥冬多糖水提液的乙醇濃度不斷增加，多糖得率逐步升高，當(dāng)乙醇用量超過(guò)60 mL 時(shí)，多糖得率趨于穩(wěn)定，這表明采用60 mL 乙醇進(jìn)行醇沉?xí)r，水提液中的大部分多糖已經(jīng)被沉降。

2.1.4 提取溫度對(duì)麥冬多糖得率的影響

稱(chēng)取5 份質(zhì)量為10 g 的麥冬粉末，按液料比8 ∶1（mL/g）加入蒸餾水，分別置于 50、60、70、80、90 ℃的恒溫水浴鍋中提取1.5 h，醇沉?xí)r加入50 mL 95 %乙醇，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction yield of polysaccharides

由圖5 可知，隨著溫度的升高，麥冬多糖的得率逐步增大。當(dāng)溫度由50 ℃上升至80 ℃時(shí)，多糖得率上升明顯，當(dāng)溫度超過(guò)80 ℃時(shí)，多糖得率上升趨勢(shì)趨緩。溫度越高，多糖分子擴(kuò)散速度加快，相同提取時(shí)間內(nèi)，多糖得率越高[20]。

2.2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)分析

2.2.1 設(shè)計(jì)因素和水平

綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)法對(duì)提取工藝進(jìn)行分析并優(yōu)化。通過(guò)Data Processing System 軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分析因素及水平編碼表見(jiàn)表1。

2.2.2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果與分析

麥冬多糖提取的二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析表見(jiàn)表3。

試驗(yàn)號(hào)根據(jù)多項(xiàng)式回歸方程Y=b0+∑biXi+∑bijXiXj+∑Xii，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出擬合方程的各項(xiàng)系數(shù)，得到回歸方程：Y=19.430 00＋0.700 83X1－0.020 83X2＋1.010 83X3＋0.685 00X4－0.684 79X12－0.836 04X22－0.511 04X32－0.792 29X42＋0.232 50X1X2－0.210 00X1X3－0.027 50X1X4＋0.108 75X2X3－0.083 75X2X4＋0.238 75X3X4。

表1 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)法分析的因素和水平Table 1 Factors and levels of quadratic general rotary unitized design

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of results

由表3 可知，在單因素試驗(yàn)中，只有液料比（X2）這個(gè)因素的效果不顯著，剔除α=0.10 的不顯著項(xiàng)后[21-24]，顯著項(xiàng)的各個(gè)系數(shù)都可由表而知，得到得率對(duì)試驗(yàn)因素的回歸方程：Y=19.430 00＋0.700 83X1＋1.010 83X3＋0.685 00X4－ 0.684 79X12－ 0.836 04X22－ 0.511 04X32－0.792 29X42。

2.3 單因素分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)單因素進(jìn)行效應(yīng)分析，結(jié)果見(jiàn)表4 及圖6。

表4 單因素效應(yīng)分析Table 4 Effect analysis of single factor

圖6 各單因素與多糖得率的關(guān)系Fig.6 Relationship of single factors and yield of water soluble polysaccharide

由表4 和圖6 可知，提取時(shí)間影響得率變化最大，然后依次是提取溫度和乙醇用量，液料比最小。

當(dāng)試驗(yàn)水平為0.500 0 時(shí)，即提取時(shí)間為1.75 h時(shí)，多糖的得率最高，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因?yàn)闊崴釙r(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，多糖的組分則比較容易降解，使分子內(nèi)和分子間的氫鍵等弱相互作用力失效加劇降解，造成得率下降[21]。

乙醇用量的試驗(yàn)水平在0.500 0 時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)乙醇用量為65 mL。繼續(xù)增加乙醇用量時(shí)，多糖得率降低。

當(dāng)提取溫度的試驗(yàn)水平為1.000 0 時(shí)，即提取時(shí)溫度設(shè)置為80 ℃，麥冬多糖的得率達(dá)到最高。當(dāng)溫度繼續(xù)增加時(shí)，多糖的耐熱性較差容易降解[17]，使得得率下降。

多糖從麥冬中溶出是一個(gè)由濃度差推動(dòng)的擴(kuò)散過(guò)程[22]，在理論上講，水提時(shí)加入的蒸餾水越多，多糖就越容易擴(kuò)散。然而除了多糖擴(kuò)散的因素之外，也受細(xì)胞組織的影響。由于后續(xù)醇沉步驟中，為節(jié)省乙醇用量，需要將多糖的水提液濃縮，因此過(guò)大的溶劑體積會(huì)對(duì)試驗(yàn)造成不便，所以液料比選 8 ∶1（mL/g）較適宜。

2.4 優(yōu)化與驗(yàn)證

由試驗(yàn)結(jié)果可知，在試驗(yàn)中不但存在著單因素效應(yīng)，而且還有因素間的相互作用。綜合考慮試驗(yàn)中一些條件限制，比如熱水提取時(shí)加入蒸餾水的量不宜過(guò)大、提取溫度不宜過(guò)高等，需要對(duì)本文中回歸模型再進(jìn)行更深一步的研究。采用頻數(shù)分析法分析此模型確定最優(yōu)良的工藝條件，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 各變量取值的頻數(shù)分布Table 5 Probability distribution of variables

由表5 可知，麥冬多糖的最優(yōu)提取條件為：乙醇用量區(qū)間為 63.45 mL～67.28 mL、液料比區(qū)間為 7.69 ∶1（mL/g）～8.31 ∶1（mL/g）、提取溫度區(qū)間為 76.98 ℃～80.58 ℃、提取時(shí)間區(qū)間為1.651 h～1.837 h。在此范圍內(nèi)，考慮到實(shí)際的可操作性，結(jié)合單因素效應(yīng)分析結(jié)果，將最佳工藝條件定為：乙醇用量 65 mL、液料比為 8 ∶1（mL/g）、提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為1.7 h，在最佳條件下，麥冬多糖理論得率為20.29%。

通過(guò)驗(yàn)證得到麥冬多糖得率為20.17%，和理論值較為接近，表明本文擬合得到的回歸方程能夠較好的應(yīng)用于麥冬多糖的提取。

2.5 麥冬多糖物DPPH自由基清除能力

麥冬多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 麥冬多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of Liriope spicata polysaccharide on DPPH free radicals

試驗(yàn)結(jié)果表明，麥冬多糖對(duì)DPPH 自由基具有一定的清除能力，且清除能力與麥冬多糖濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，即隨著麥冬多糖濃度的增加其清除DPPH 自由基的能力也在逐漸增加。當(dāng)麥冬多糖濃度達(dá)到100 mg/mL 時(shí)，麥冬多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到63.78%，且趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本文采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)有助于克服二次回歸正交設(shè)計(jì)的缺陷，即二次回歸預(yù)測(cè)值依賴(lài)于試驗(yàn)點(diǎn)在因子空間中的位置，不能根據(jù)預(yù)測(cè)值直接尋找最優(yōu)區(qū)域，減少了誤差的干擾，從而易于得到組合較優(yōu)的提取條件。最終確定最佳提取工藝條件為：10 g 麥冬粉末，乙醇用量 65 mL、液料比為 8 ∶1（mL/g）、提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為1.7 h，麥冬多糖得率為20.17%。麥冬多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力隨著麥冬多糖濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)麥冬多糖濃度達(dá)到100 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到63.78%，且趨于穩(wěn)定。

目前，麥冬多糖的提取方法，除了水提醇沉法，還有酶提取法、微波提取法，酶提取法提取條件較溫和，可明顯提高植物成分的提取效率，但成本較高[25]。微波超聲法能夠提升釋放多糖的速度，縮短提取時(shí)間，但是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)多糖會(huì)發(fā)生降解，影響多糖的得率[12]。水提醇法成本較低，提取方法簡(jiǎn)單方便，適合于大規(guī)模生產(chǎn)，因此，研究水提醇沉麥冬多糖的最佳工藝參數(shù)和抗氧化活性可為今后深入研究和開(kāi)發(fā)利用麥冬多糖提供參考。