許河南，王月月,2，陳天天，閆 雷，王文銳，楊清玲，陳昌杰

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一。過去20 年中國女性乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢，預(yù)計(jì)到2030年，全球乳腺癌的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)將分別達(dá)到264萬和170萬[1-2]?；熢诮档腿橄侔┺D(zhuǎn)移率和死亡率方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[3]。

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是從紅豆杉屬植物提取的一種具有廣譜、高效抗癌活性的二萜類化合物，能夠有效抑制微管蛋白的解聚并保持其穩(wěn)定，從而抑制癌細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)程，最終達(dá)到抑制腫瘤增殖的作用[4]。紫杉醇對乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等具有良好的治療作用，是治療復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床一線化療藥，但存在水溶性低，生物利用度較差，不良反應(yīng)大等缺點(diǎn)[5]，同時，紫杉醇是P-糖蛋白(P-gp)底物，P-gp泵可將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，也是導(dǎo)致乳腺癌紫杉醇化療失敗的主要原因[6]。

納米載藥系統(tǒng)在有效進(jìn)行藥物輸送、提高藥物靶向濃度、降低藥物對正常組織的毒性和克服化療藥物耐藥性等方面為化療藥物的發(fā)展提供了新的解決途徑[7]。PEG-DSPE是聚乙二醇的磷脂衍生物，為兩性高分子化合物，既含有親水的聚乙二醇又含有疏水的腦磷脂，在水中的性質(zhì)近似于表面活性劑，以膠束的形式存在[8]。當(dāng)PEG-DSPE與脂質(zhì)體混合時，其疏水端插入脂質(zhì)體雙分子膜，使PEG-DSPE親油的羧基嵌入脂質(zhì)體形成穩(wěn)定的聚乙二醇保護(hù)層，避免了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對它的吞噬作用，延長了脂質(zhì)體在血液中的循環(huán)時間[9]。

維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS) 在納米藥物系統(tǒng)的應(yīng)用得到廣泛研究。美國 FDA 早已批準(zhǔn) TPGS 作為一種安全的藥用輔料，可廣泛應(yīng)用于藥用處方中，在制劑中可作為增溶劑、吸收促進(jìn)劑、乳化劑、增塑劑、致孔劑及固體分散體的載體等[10]。TPGS作為一種生物材料，具有良好的促進(jìn)吸收作用和抗多重藥耐藥作用，增強(qiáng)細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性，具有良好的生物粘附性能，尤其是對ATP 結(jié)合盒 (ATP binding cattle，ABC) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族有較強(qiáng)的抑制作用[11]。TPGS 作為一種非離子表面活性劑，不僅能夠抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的P-gp 泵，其本身也是一種兩親性共聚物，具有較強(qiáng)的藥物乳化能力，因此可將其應(yīng)用于納米混懸劑的輔助穩(wěn)定劑[12]。

為了有效提高紫杉醇抗腫瘤效應(yīng)，降低不良反應(yīng)及提高逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用，本研究擬選用PEG-DSPE作為納米載體，構(gòu)建TPGS修飾的紫杉醇長循環(huán)膠束給藥系統(tǒng)，考察該給藥系統(tǒng)在體外的抗腫瘤效應(yīng)及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用，為開發(fā)新型的抗癌藥物給藥系統(tǒng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；胎牛血清購自 Hyclone 公司； DMEM 高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司； PEG2000-DSPE購買于艾韋特公司；紫杉醇粉劑購買于美侖生物公司；TPGS購買于阿拉丁生化公司；聚偏氟乙烯(PVDF膜)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司；Transwell小室買于Corning公司；Annexin V & Dead Cell凋亡試劑盒購買于Muse公司。一抗Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、Caspase-3、β-actin、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)、多藥耐藥基因1(multidrug resistance 1，MDR1)及其編碼產(chǎn)物P-gp購自Proteintech公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔、兔抗鼠二抗購自北京中山金橋有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7紫杉醇耐藥細(xì)胞株(MCF-7/PR)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，構(gòu)建方案采用紫杉醇體外濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使其能在含有10 μmol/L濃度的紫杉醇培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長6個月以上以維持其耐藥性[13]。所有細(xì)胞在含10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3～4 d傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 紫杉醇聚合物膠束的制備及表征 采用薄膜分散法制備紫杉醇球狀膠束，按處方稱取一定量的PTX、TPGS、DSPE-PEG2000(TPGS與DSPE-PEG2000 的摩爾比分別為1∶10，藥脂比為1∶20，w/w)，置于圓底燒瓶中。加入適量的甲醇，超聲并水浴使其充分溶解，將混合溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上溫度保持45 ℃左右，轉(zhuǎn)速100 r/min，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸干。形成半透明薄膜后，隨即加入PBS 緩沖液對形成的脂膜進(jìn)行水化，并在室溫下孵育12 h，10 000 r/min離心10 min去除未包載的紫杉醇，沉淀收集在凍干瓶中并在-80 ℃下保存8 h以備后續(xù)凍干，在-55 ℃下減壓下初步干冷凍干燥36 h獲得紫杉醇膠束凍干粉末。將納米顆粒溶液放置于400目碳包埋的銅網(wǎng)上，隨后通過透射電鏡檢測其納米顆粒的形態(tài)。將制備好的紫杉醇膠束凍干粉末，取適量稀釋后，室溫下放入粒徑分析檢測器中，檢測粒徑；同時另取稀釋好的紫杉醇膠束溶液置于電位杯中，對Zeta 電位進(jìn)行測定。

1.2.3 磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)染色檢測細(xì)胞的增殖活性 對數(shù)生長期細(xì)胞消化后離心，制成單細(xì)胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁生長。按對細(xì)胞進(jìn)行加藥處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h終止培養(yǎng)，吸出培養(yǎng)基，每孔加入200 μL 10%三氯乙酸(TCA)，4 ℃固定50 min，用雙蒸水洗滌5次，室溫下干燥；每孔加入100 μL 0.4% SRB染液染色30 min，用1%乙酸溶液洗滌5次后干燥，每孔加入150 μL 10 mmol/L Trisbase溶液，搖床上劇烈振蕩15 min，待SRB染液充分溶解，酶標(biāo)儀檢測波長515 nm處的吸光度值。存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)。

1.2.4 Annexin V/PI染色檢測細(xì)胞凋亡 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度后接種于6孔板中，每孔加入2 mL培養(yǎng)基，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行加藥處理，24 h后0.25%不含EDTA胰酶消化離心，收集全部細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次；按照凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液接種于6孔板，培養(yǎng)過夜細(xì)胞貼壁生長，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時，10 μL無菌槍頭使用相同力度在細(xì)胞板中間輕輕劃出一道劃痕，注意保持各組劃出劃痕的寬度基本一致，用PBS沖洗3次，再對細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)的加藥處理，分別于加藥后0、24 h在低倍鏡下測量各組細(xì)胞任意3個部位的不同痕跡寬度。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基將每組的細(xì)胞調(diào)整到相同細(xì)胞密度。按照實(shí)驗(yàn)分組，每組各取100 μL 加入Transwell 小室的上室。Transwell 小室底部預(yù)先加入60 μL已稀釋的Matrigel基底膜基質(zhì)膠，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽小心擦去Transwell小室上室的培養(yǎng)基以及膜上部未穿過的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，吉姆薩染液染色，拍照觀察高倍鏡下穿過的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.7 蛋白印跡法檢測蛋白表達(dá) 按對照組、紫杉醇組、紫杉醇膠束組處理細(xì)胞，消化細(xì)胞后用預(yù)冷PBS洗滌，每組加入80 μL蛋白裂解液充分混勻，冰上裂解30 min后4 ℃離心15 min吸取上清液；蛋白質(zhì)二喹啉甲酸法(BCA法)進(jìn)行定量分析；加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×，蛋白于95 ℃煮15 min，蛋白樣品總量為25 μL，Marker上樣量為5 μL，100 V、10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)1.5 h；電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)置甲醇活化后的PVDF膜，5%的脫脂奶粉溶于TBS-T中，將膜放入進(jìn)行封閉2 h。孵育一抗，分別加入鼠抗人Bax、β-actin抗體，兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、MRP、P-gp(工作濃度1∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜，TBS-T緩沖液洗滌PVDF膜4次，每次8 min；HRP標(biāo)記的羊抗兔、兔抗鼠二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h后洗膜，進(jìn)行BIO-RAD成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析灰度結(jié)果，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇聚合物膠束的形貌、粒徑和電位分析 采用“薄膜分散法”制備了紫杉醇長循環(huán)膠束納米粒，游離的紫杉醇在PBS中溶解度差，而經(jīng)搭載的紫杉醇膠束在PBS中溶解性較好，分散較均勻(見圖1A)。紫杉醇膠束經(jīng)負(fù)染后在電鏡下觀察呈圓球形，粒徑30～40 nm，PCS分析水合粒徑也在30 nm左右，與電鏡結(jié)果一致(見圖1B、1C)。紫杉醇膠束電位為-5.4 mV，利用紫外分光光度計(jì)測得紫杉醇在膠束系統(tǒng)中的載藥量為25.37%(見圖1D)。

2.2 SRB法檢測不同濃度紫杉醇和紫杉醇膠束對乳腺癌耐藥細(xì)胞增殖作用的影響 各濃度紫杉醇膠束組細(xì)胞存活率均低于紫杉醇組和對照組(P<0.01)(P<0.01)(見表1)。

2.3 紫杉醇和紫杉醇膠束對MCF-7/PR凋亡的影響 采用流式分析實(shí)驗(yàn)對紫杉醇和紫杉醇膠束(1 μmol/L)對MCF-7/PR凋亡的影響進(jìn)行了研究，與紫杉醇組比較，紫杉醇膠束組誘導(dǎo)乳腺癌耐藥細(xì)胞株的凋亡能力更強(qiáng)(P<0.01) (見圖2、表2)。

分組0.1 μmol/L0.5μmol/L1μmol/L對照組101.44±1.86102.21±1.31100.68±1.99紫杉醇組91.09±3.7480.94±8.7267.52±3.73紫杉醇膠束組76.57±0.72??70.30±5.70??55.41±4.49??F78.12121.547183.120P<0.01<0.01<0.01MS組內(nèi)5.99736.75312.682

q檢驗(yàn):與對照組、紫杉醇組比較**P<0.01

分組n早期凋亡率對照組31.24±0.57紫杉醇組31.96±0.25紫杉醇膠束組32.93±1.36??F—11.67P—<0.01MS組內(nèi)— 0.180

q檢驗(yàn):與對照組、紫杉醇組比較**P<0.01

2.4 紫杉醇及紫杉醇膠束對乳腺癌耐藥細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)研究了紫杉醇以及紫杉醇膠束組對乳腺癌耐藥細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，紫杉醇組的遷移率明顯下降，而紫杉醇膠束組的遷移率下降更為明顯(見圖3)。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對于對照組和紫杉醇組，紫杉醇膠束組細(xì)胞的侵襲數(shù)目和遷移率均明顯降低(P<0.01)(見表3)。

分組n侵襲細(xì)胞數(shù)/個遷移率/%對照組3162±6.1174.46±2.11紫杉醇組3127±4.3642.92±0.46紫杉醇膠束組3 97±1.53?? 19.80±0.56??F—162.4491357.43P—<0.01<0.01MS組內(nèi)—19.5561.664

q檢驗(yàn):與對照組、紫杉醇組比較**P<0.01

2.5 紫杉醇及紫杉醇膠束對乳腺癌耐藥細(xì)胞凋亡蛋白和耐藥相關(guān)蛋白的影響 采用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)研究紫杉醇及紫杉醇膠束對乳腺癌耐藥細(xì)胞凋亡蛋白和耐藥相關(guān)蛋白的影響。與對照組和紫杉醇組比較，而紫杉醇膠束組Bcl-2的表達(dá)量明顯減少，Caspase-3以及Bax的表達(dá)明顯增加(P<0.01)。化療后腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的MDR常導(dǎo)致化療失敗。MDR與 P-gp 和MRP高表達(dá)相關(guān)。相對于對照組和紫杉醇組，紫杉醇膠束組能夠明顯抑制P-gp和MRP的表達(dá)水平(P<0.01)(見圖4、表4)。

3 討論

腫瘤的多藥耐藥是導(dǎo)致傳統(tǒng)化療失敗的重要原因，與過度表達(dá)藥物外排泵、細(xì)胞凋亡機(jī)制的缺陷、突變的分子靶點(diǎn)、腫瘤的微環(huán)境、缺氧及胞外低pH 等機(jī)制有關(guān)。利用納米顆粒容易進(jìn)入細(xì)胞的特點(diǎn)，納米顆粒作為運(yùn)載體有效逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥。為了探索克服腫瘤耐藥的有效治療方式，本課題選用紫杉醇為模型藥物，設(shè)計(jì)了一種對腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的基于TPGS修飾的PEG-DSPE膠束系統(tǒng)，研究了其在逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥性方面的能力。

PEG-DSPE 納米膠束是體內(nèi)可降解并經(jīng)FDA批準(zhǔn)的可用于人體的藥物載體材料，這種兩親性共聚物能在水介質(zhì)中形成具有疏水性內(nèi)核與親水性外殼的超分子聚集體，疏水性內(nèi)核包載藥物，提高難溶性藥物的溶解度，同時可避免藥物降解；而PEG親水性外殼有助于納米膠束在血液中的長時間循環(huán)，因此PEG-DSPE 納米膠束常用于難溶性藥物的增溶載體。

TPGS由維生素E琥珀酸酯的羧基與聚乙二醇1000(PEG1000)的羥基酯化而成，是由美國 FDA 批準(zhǔn)的生物安全性高的高分子聚合物。TPGS 具有兩親性結(jié)構(gòu)，由親油性的烷基尾(維生素 E)和親水性的極性頭(PEG)組成，具有良好的生物相容性和理化性質(zhì)。基于TPGS 的抗腫瘤藥物納米制劑具有藥物包封率高、體內(nèi)循環(huán)時間長、口服生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)。更為重要的是，TPGS 還是一種高效的P-gp抑制劑，能與P-gp非轉(zhuǎn)運(yùn)活性位點(diǎn)結(jié)合，影響細(xì)胞膜的流動性，從而導(dǎo)致 P-gp 構(gòu)象發(fā)生改變。

表4 紫杉醇和紫杉醇膠束處理乳腺癌耐藥細(xì)胞后對凋亡相關(guān)蛋白和耐藥蛋白表達(dá)的影響

分組nMRPP-gpCaspase-3BaxBcl-2對照組31.00±0.0021.00±0.0081.00±0.0051.00±0.0081.00±0.001紫杉醇組30.97±0.0050.95±0.0151.18±0.0121.13±0.0060.85±0.004紫杉醇膠束組30.79±0.005??0.81±0.008??1.33±0.010??1.38±0.048??0.79±0.011??F—2107.01256.28902.97139.20704.85P—<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01MS組內(nèi)—0.0000.0000.0000.0010.000

q檢驗(yàn)：與對照組、紫杉醇組比較**P<0.01

細(xì)胞凋亡基因過表達(dá)凋亡抑制蛋白和膜蛋白介導(dǎo)的藥物外排是產(chǎn)生腫瘤多藥耐藥最為重要的機(jī)制。細(xì)胞凋亡是由一系列信號分子精密調(diào)控的程序性死亡過程，信號傳導(dǎo)過程可以分為兩條基本途徑：外源性的凋亡主要依賴于位于細(xì)胞膜表面連接的死亡受體激活Caspase信號通路，而內(nèi)源性凋亡主要是由Caspase依賴性和非依賴于Caspase的通路激活線粒體內(nèi)在通路。Bcl-2 和Bax分別是Bcl-2 族中重要的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇膠束組能夠更加有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上調(diào)Caspase-3、Bax的表達(dá)，而Bcl-2 的表達(dá)下降，這一結(jié)果可能會促使腫瘤耐藥細(xì)胞內(nèi)線粒體膜通透性增加，線粒體發(fā)生膨脹，引起下游Caspase-3 的激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

P-gp是一種相對分子質(zhì)量為170 000的跨膜糖蛋白，高度表達(dá)于耐藥腫瘤細(xì)胞膜上，可能量依賴性地將藥物泵出細(xì)胞，并減少藥物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)藥物的蓄積減少，從而產(chǎn)生耐藥性。MRP具有像P-gp一樣的外排抗腫瘤藥物的能力，與ATP結(jié)合并水解ATP之后將胞質(zhì)內(nèi)的抗腫瘤藥物外排出細(xì)胞，從而降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，降低藥效。因此，提高化療藥物的有效濃度仍然是目前克服腫瘤耐藥的主要可行方法。本實(shí)驗(yàn)利用TPGS修飾的PEG-DSPE膠束搭載紫杉醇，可以有效預(yù)防藥物分子被外排泵識別，并且在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證明PEG2000-DSPE-TPGS-PTX相對于紫杉醇更有效地減低P-gp和MRP的蛋白表達(dá)水平。

根據(jù)課題前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了PTX藥物濃度梯度，在所選藥物濃度梯度范圍內(nèi)進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，乳腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株的生長抑制情況存在較明顯的差異性，且濃度選擇均小于IC50，避免了細(xì)胞大量死亡而干擾相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測，便于觀察對比各組間差異。

另外，乳腺癌病人化療過程中,多西紫杉醇血藥濃度-時間曲線下面積 (AUC)與療效及不良反應(yīng)相關(guān)[14]。根據(jù)相關(guān)研究數(shù)據(jù),中國病人應(yīng)用多西紫杉醇AUC值的正常范圍可考慮為1.0～3.0 μmol·h-1·L-1。根據(jù)AUC正常范圍值調(diào)整紫杉醇用量有望減少不良反應(yīng)的發(fā)生[15]。因此，課題實(shí)驗(yàn)紫杉醇濃度選擇為1 μmol/L，可更加合理地指導(dǎo)紫杉醇的臨床應(yīng)用。

綜上所述，TPGS修飾的紫杉醇長循環(huán)膠束給藥系統(tǒng)，可有效在體外發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用，可以為開發(fā)新型的抗癌藥物給藥系統(tǒng)提供一定的參考依據(jù)。