焦 瑋,魏 凌，胡明明，李建國(guó)

放射治療(放療)是乳腺癌治療的重要手段之一，而腫瘤細(xì)胞對(duì)放射的不敏感性是影響放射治療的重要因素。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明,乳腺癌細(xì)胞中特異或差異性表達(dá)的一些微小RNA(microRNAs，miRNAs)在放療抵抗過程中發(fā)揮著重要作用，而干擾或過表達(dá)這些miRNAs可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的抵抗，增加放療的敏感性[1-3]。miRNA(miR)-125b與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)miRNA，在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和耐藥等方面發(fā)揮著重要作用[4]。miR-125b在乳腺癌等中異常低表達(dá)，被證實(shí)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和放療過程過程中發(fā)揮著積極作用[5-6]，但其在腫瘤細(xì)胞放射增敏過程中的機(jī)制卻知之甚少。己糖激酶-2(HK2)是糖酵解過程中的一種關(guān)鍵限速酶，被證實(shí)沉默其表達(dá)可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性[7]。本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，HK2可能是miR-125b的潛在靶基因。因此，猜測(cè)miR-125b可能通過靶向抑制HK2表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮放射增敏作用，故設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。本研究以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象，通過觀察miR-125b和HK2的靶向關(guān)系，探討miR-125b增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞放射敏感性的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，二甲基亞砜、MTT試劑和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，PVDF膜購(gòu)于德國(guó)Roche公司，兔抗人β-action多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cuze公司，鼠抗人HK2單克隆抗體購(gòu)于美國(guó) Abcam公司，辣根標(biāo)記羊抗兔/鼠IgG二抗購(gòu)于北京博奧森公司?？俁NA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化公司，Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒和SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購(gòu)于上海Beyotime公司，AnnexinV-APC/7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基公司，HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒購(gòu)和蛋白抽提試劑盒于北京康為世紀(jì)生物公司，Promega雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海力敏實(shí)業(yè)公司。miR-125b模擬物及其陰性對(duì)照以及HK2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HK2由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)合成。凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)BIO-RAD公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于蘇州凈化設(shè)備制造廠，流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Becton Dickinson公司，醫(yī)用直線加速器購(gòu)于美國(guó) Varian公司，PCR儀購(gòu)于德國(guó)SensoQuest Lab Cycler公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 采用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清) 于5%二氧化碳的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞(來自于中科院上海細(xì)胞庫)。當(dāng)細(xì)胞融合度超過85%時(shí)，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)所有細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)至70%～80%匯合度時(shí)，參照LipofectamineTM2000說明書將miR-125b模擬物及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，并標(biāo)記為miR-125b組和miR-NC組。轉(zhuǎn)染5 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果。

1.3 RT-PCR檢測(cè)miR-125b和HK2mRNA的表達(dá) 根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書步驟提取MCF-7細(xì)胞的總RNA，并采用核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)RNA的濃度。按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。由上海生工合成的PCR引物分別為miR-125b正向引物：5′-CGT CCC TGA GAC CCT AAC TTG T-3′，反向引物：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；內(nèi)參U6正向引物：5′-GCG CGT CGT GAA GCG TTC-3′，反向引物：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；HK2正向引物：5′-AAG GCT TCA AGG CAT CTG-3′，反向引物：5′-CCA CAG GTC ATC ATA GTT CC-3′；內(nèi)參β-actin正向引物：5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GG-3′，反向引物：5′-CGT GAG AAG GTC GGA AGG AA-3′。取PCR正反向引物(濃度為10 μmol/L)各2 μL、模板cDNA 2 μL、2×Taq Master Mix 25 μL和RNase-Free Water 18 μL配制成總體積為50 μL的PCR反應(yīng)體系，上PCR儀按照94 ℃ 2 min(預(yù)變性)，94 ℃ 30 s(變性)、58 ℃ 30 s(退火)、72 ℃ 30 s(延伸)，共38個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用2-△△CT法檢測(cè)miR-125b和HK2 mRNA的表達(dá)水平。

1.4 Western blotting檢測(cè)HK2蛋白的表達(dá) 參照蛋白抽提試劑盒說明書步驟提取MCF-7細(xì)胞的總蛋白后，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與1/4體積的5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液混勻后置于沸水中煮沸5 min。取變性蛋白，以每孔60 μg上樣至SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳。待蛋白充分分離后，結(jié)束電泳。采用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。取出PVDF膜，置于含5%脫脂奶粉TBST 封閉液中封閉1 h。封閉液洗膜后，加入封閉液稀釋的HK2抗體(工作濃度1∶500)，4 ℃孵育24 h。洗膜后，加入辣根標(biāo)記羊抗兔/鼠IgG二抗(工作濃度1∶1 000)室溫下孵育2 h。再次洗膜后，采用化學(xué)發(fā)光法顯影及定影，BIO-RAD成像儀分析。以目的蛋白HK2與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比較表示HK2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-125b和HK2的靶向關(guān)系 采用TargetScan預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)HK2 3′UTR 與miR-125b存在互補(bǔ)的核苷酸序列。為了驗(yàn)證miR-125b和HK2之間是否存在靶向關(guān)系，分別設(shè)計(jì)合成野生型(HK2-WT)和突變型(HK2-MUT)的HK2 3′UTR熒光素酶報(bào)告載體，將其分別與miR-125b 模擬物及其陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，并分別標(biāo)記為miR-125b+HK2-WT組、miR-125b+HK2-MUT組、miR-NC+HK2-WT組和miR-NC+HK2-MUT組。轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞照射 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞分為3組：miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物陰性對(duì)照)、miR-125b組(轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物)和miR-125b+HK2組(轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物和pcDNA3.1-HK2質(zhì)粒)。根據(jù)上述分組采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染48 h后，采用6MV-X射線對(duì)各組細(xì)胞按照200 cGy/min照射劑量率、20 cm×20 cm照射野面積和100 cm固定源皮距進(jìn)行照射。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù) 胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×103個(gè)/毫升，按照每孔2 mL接種至6孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)過夜。以0、2、4、6和8 Gy劑量的X射線垂直照射各組細(xì)胞，照射結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)12 d后終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液后，以甲醇固定細(xì)胞10 min，姬姆薩染液染色20 min。顯微鏡下觀察，以超過50個(gè)細(xì)胞集落作為有效克隆，以(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%表示克隆形成率(PE)，并根據(jù)公式：存活分?jǐn)?shù)(SF)=克隆數(shù)/(PE×接種細(xì)胞數(shù))計(jì)算各組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)。根據(jù)多靶單擊模型擬合細(xì)胞存活曲線，記錄平均致死量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)、2Gy劑量下對(duì)應(yīng)的SF值(SF2)和增敏比(SER)放射生物學(xué)參數(shù)。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 給予4 Gy劑量X射線照射后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，使每毫升細(xì)胞懸液中含有105個(gè)細(xì)胞。參照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書步驟檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用單因素方差分析、q檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物上調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中miR-125b的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物后MCF-7細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)水平(4.25±0.16)較miR-NC組(0.96±0.07)顯著升高(t=32.63，P<0.01)。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物下調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HK2 mRNA和蛋白的表達(dá) RT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物后MCF-7細(xì)胞中HK2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別為0.35±0.03和0.27±0.03，較miR-NC組中HK2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(1.02±0.09和0.88±0.07)均顯著降低(tmRNA=12.23，P<0.01；t蛋白=13.87，P<0.01)(見圖1)。

2.3 HK2是miR-125b的靶基因 TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，HK2的3′UTR中存在與miR-125b互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，詳見表1。同時(shí)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物和HK2-WT質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞的熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染miR-NC和HK2-WT質(zhì)粒的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)；但與共轉(zhuǎn)染miR-NC和HK2-MUT質(zhì)粒相比，共轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物和HK2-MUT質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著改變(P>0.05)(見表2)。

表1 miR-125b與HK2 3′ UTR的結(jié)合位點(diǎn)

表2 各MCF-7細(xì)胞的熒光素酶活性的比較

q檢驗(yàn)：與miR-NC + HK2-WT組比較* *P<0.01

2.4 miR-125b過表達(dá)靶向調(diào)控HK2增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞放射敏感性 RT-PCR檢測(cè)得到miR-NC組、miR-125b組和miR-125b+HK2組細(xì)胞中HK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.06、0.34±0.02和0.65±0.03，Western blotting檢測(cè)得出HK2蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.08、0.27±0.02和0.45±0.03(見圖2)；各組細(xì)胞間HK2 mRNA和蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FmRNA=200.27，P<0.01，MS組內(nèi)=0.002；F蛋白=179.18，P<0.01，MS組內(nèi)=0.003)；與miR-NC組相比，HK2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平在miR-125b組細(xì)胞中顯著降低(P<0.01)，而miR-125b+HK2組與miR-125b組相比顯著升高(P<0.01)。根據(jù)打擊多靶模型擬合MCF-7細(xì)胞的生存曲線見圖3，各組細(xì)胞的放射相關(guān)參數(shù)見表2。與miR-NC組相比，miR-125b組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.01)，放射增敏比SER為1.44；與miR-125b組相比，miR-125b+HK2組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)明顯升高(P<0.01)，細(xì)胞增敏比為0.69。給予4 Gy劑量X射線照射后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-NC組、miR-125b組和miR-125b+HK2組的細(xì)胞凋亡率分別為(7.58±0.12)%、(20.64±0.23)%和(13.26±0.13)% ；與miR-NC組相比，miR-125b組細(xì)胞凋亡率明顯升高(t=86.31，P<0.01)；而miR-125b+HK2組細(xì)胞的凋亡率較miR-125b組顯著降低(t=47.91，P<0.01)(見圖4)。

表3 各組細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù)比較

分組D0/GyDq/GySF2SERmiR-NC2.473.480.91miR-125b1.261.350.491.44miR-125b+HK21.821.580.620.69

3 討論

miRNAs是一類可通過與靶基因3′UTR區(qū)域特異性結(jié)合調(diào)控靶基因表達(dá)的短鏈非編碼 RNA，腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)的miRNAs不僅與細(xì)胞的DNA修復(fù)、增殖和凋亡等有關(guān)，還與細(xì)胞的放射敏感性關(guān)系密切[8-9]。本研究關(guān)注的miR-125b就是一個(gè)很好的例子?？谇击[癌中下調(diào)的miR-125b表達(dá)與細(xì)胞增殖和抗輻射機(jī)制有關(guān)，上調(diào)其表達(dá)可增強(qiáng)放射的敏感性[10]。miR-125b在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，而上調(diào)其表達(dá)可通過靶向KIAA1522抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[5]；同時(shí)，強(qiáng)制表達(dá)miR-125b可通過降低克隆生存率、增強(qiáng)凋亡活性和增強(qiáng)紅外線后的衰老等提高放射敏感性[6]。然而，miR-125b在乳腺癌細(xì)胞放射致敏中的分子機(jī)制并不完全清楚。miRNA可與靶基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)，本研究認(rèn)為miR-125b可能通過調(diào)控其靶基因發(fā)揮放射增敏作用。

有研究[11-12]證實(shí)，miR-125b在骨肉瘤和喉鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，可通過直接靶向調(diào)控HK2表達(dá)抑制癌細(xì)胞的有氧糖酵解過程，進(jìn)而抑制腫瘤的惡性進(jìn)展。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物上調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的miR-125b表達(dá)后，檢測(cè)到HK2從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均明顯受到抑制；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步檢測(cè)證實(shí)miR-125b可與HK2 3′UTR區(qū)域結(jié)合。這表明HK2是miR-125b的潛在靶基因。

電離輻射使細(xì)胞DNA雙鏈斷裂進(jìn)而引起癌細(xì)胞死亡的過程是放射治療的內(nèi)在機(jī)制，而機(jī)體細(xì)胞自身的DNA修復(fù)系統(tǒng)是導(dǎo)致放射不敏感的重要機(jī)制；HK2是糖酵解起始過程中的關(guān)鍵限速酶，而糖酵解過程產(chǎn)生的ATP是DNA合成獲得能量的重要方式，可見HK2與DNA修復(fù)斷裂關(guān)系密切[13-14]。同時(shí)，HK2還是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)的致癌基因，在腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡中發(fā)揮著重要作用，并介導(dǎo)腫瘤的治療耐受。HK2在胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)上調(diào)，敲低其表達(dá)通過降低乳酸的產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，上調(diào)其表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[15]；在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，靶向抑制HK2表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射化療反應(yīng)[16]；在HPV16 E7誘導(dǎo)的宮頸癌中，靶向抑制HK2表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。已有研究[7,18]證實(shí)，靶向抑制HK2表達(dá)可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性。本研究在上調(diào)miR-125b表達(dá)后進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，X射線照射的MCF-7細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)降低，凋亡率升高，這表明miR-125b過表達(dá)可增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的放射敏感性；而轉(zhuǎn)染HK2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HK2成功上調(diào)HK2表達(dá)后，miR-125b過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞的放射增敏作用明顯受到抑制，提示miR-125b可通過靶向抑制HK2增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的放射敏感性。

綜上所述，miR-125b在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中發(fā)揮著放射增敏作用，而靶向抑制HK2表達(dá)可能是其重要的分子機(jī)制，為miR-125b成為乳腺癌放射增敏的分子靶點(diǎn)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。