顧 雪，余美玲，肖成煒，張苗苗，王才智

卵巢癌是女性生殖器官最常見的三大惡性腫瘤之一，在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率居第2位，其病死率居首位[1]，其中卵巢漿液性癌占卵巢癌的75%。由于卵巢位置較深，早期病變不易發(fā)現(xiàn)，缺乏特異的早期臨床表現(xiàn)及診斷方法，約70%的卵巢癌病人在發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，并有廣泛的盆腔、腹腔、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或腹水形成[2]。

研究[3]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)反應(yīng)可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。而葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，在ERS出現(xiàn)時(shí)其表達(dá)上調(diào)[4]。GRP78的主要功能包括促進(jìn)新合成蛋白的折疊、聚集，識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的異常折疊蛋白并誘導(dǎo)其降解，充當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器等。隨著對GRP78 細(xì)胞內(nèi)定位認(rèn)識的不斷深入，研究[5-6]發(fā)現(xiàn)除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外，腫瘤細(xì)胞表面也存在 GRP78 的表達(dá)。細(xì)胞表面 GRP78 被認(rèn)為是一種受體樣多功能蛋白，可以通過與不同的配體結(jié)合，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥性中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[7-8]。目前，細(xì)胞表面 GRP78 在調(diào)節(jié)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及可能的分子機(jī)制已成為研究的熱點(diǎn)。本研究擬通過免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測GRP78在卵巢漿液性癌及卵巢漿液性囊腺瘤的表達(dá)情況，探討GRP78在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 低轉(zhuǎn)移潛能卵巢癌細(xì)胞HO-8910、高轉(zhuǎn)移潛能卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM購于上海通派生物科技公司。二甲基亞砜從Sigma-Aldrich公司購買。GRP78一抗以及二抗從Cell Signaling公司購買。shRNA-GRP78、pcDNA-GRP78和LipofectamineTM2000均從上海吉瑪基因公司購買。

收集2013年12月至2018年12月蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院存檔的60例卵巢漿液性癌組織及同時(shí)期40例卵巢漿液性囊腺瘤組織標(biāo)本。卵巢癌病人年齡46～72歲；組織學(xué)類型均為漿液性腺癌；病理分級低級23例，高級37例；臨床分期Ⅰ、Ⅱ期25例，Ⅲ、Ⅳ期35例；術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)有淋巴轉(zhuǎn)移者13例，無淋巴轉(zhuǎn)移者47例；有盆腔轉(zhuǎn)移者36例，無盆腔轉(zhuǎn)移者24例；盆腔外轉(zhuǎn)移者19例，無盆腔外轉(zhuǎn)移者41例。卵巢囊腺瘤病人年齡20～66歲，均為漿液性囊腺瘤。病例均經(jīng)手術(shù)和病理確診，術(shù)前均未接受放療、化療和免疫治療等相關(guān)治療，有完整臨床及病理資料。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)法測定GRP78的表達(dá)，樣本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm連續(xù)切片；然后依次經(jīng)過脫蠟、脫苯、水化、抗原修復(fù)、封閉內(nèi)源性過氧化物酶后，于室溫下靜置20 min，隨后在4 ℃孵育一抗過夜。然后切片孵育帶熒光標(biāo)記的二抗，室溫下孵育20 min，PBS洗片3次，每次5 min，滴加DAB顯色溶液染色2 min，并將切片置于顯微鏡下觀察顯色結(jié)果；終止反應(yīng)后以蘇木素復(fù)染1 min，鹽酸乙醇分化、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，待中性樹膠干后，置于顯微鏡下觀察拍片，并對陽性染色進(jìn)行觀察。對染色的細(xì)胞進(jìn)行如下評分：顯色細(xì)胞≤10%，為陰性(-)；顯色細(xì)胞>10%～25%，為陽性(+)；顯色細(xì)胞>25%～50%，為陽性(2+)；顯色的細(xì)胞≥50%，為陽性(3+)。按GRP78表達(dá)情況進(jìn)行分層，顯色陽性細(xì)胞<50%為低表達(dá)GRP78組，而顯色陽性細(xì)胞≥50%為高表達(dá)GRP78組，比較2組卵巢漿液性癌病人臨床指標(biāo)之間的關(guān)系。

1.2.2 Western blotting法檢測蛋白表達(dá) 組織蛋白提取操作步驟如下：取-80 ℃保存的卵巢漿液性癌組織和卵巢漿液性囊腺瘤組織標(biāo)本，在液氮下碾成粉狀，冰上裂解30 min，勻質(zhì)，1 000 r/min離心10 min，收集上清液。細(xì)胞蛋白提取操作如下：取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，使用胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于4 mL的離心管中，2 500 r/min離心10 min，棄上層液體，加細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心收集樣品。BCA法檢測樣品蛋白含量，蛋白定量后與上樣緩沖液1∶1混合，100 ℃煮沸5 min，變性的蛋白于-20 ℃保存。每道上樣30 μg蛋白，經(jīng)聚丙稀酰胺凝膠電泳后濕式轉(zhuǎn)膜。PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，最后在暗室中顯影、定影、洗凈、晾干。采用圖像分析軟件Gene Tools V3.04b分析蛋白條帶灰度，以β-actin作為內(nèi)參對照。

1.2.3 HO-8910、HO-8910PM細(xì)胞株轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為3組：對照組、陰性對照組和shRNA-GRP78或pcDNA-GRP78組。依據(jù)試劑盒操作步驟，將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，使用LipofectamineTM2000將shRNA-GRP78、pcDNA-GRP78分別轉(zhuǎn)染至HO-8910細(xì)胞、HO-8910PM細(xì)胞，再加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h，吸去上述液體，加入正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲、遷移能力 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于鋪有30 μL Matrigel基質(zhì)膠的Transwell 板上室。下室為600 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，用棉簽擦去上層細(xì)胞，下層細(xì)胞用4%多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色。將固定染色的細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察拍照，任選5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 GRP78在卵巢漿液性癌和卵巢漿液性囊腺瘤組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，GRP78蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒(見圖1)，40例卵巢漿液性囊腺瘤組織中GRP78陰性表達(dá)30例(75%)，GRP78陽性表達(dá)10例(25%)，60例卵巢漿液性癌組織中GRP78陰性表達(dá)6例(10%)，陽性表達(dá)54例(90%)；卵巢漿液性癌組織中GRP78陽性表達(dá)明顯高于卵巢漿液性囊腺瘤組織(χ2=44.01，P<0.01)。Western blotting結(jié)果顯示，GRP78在卵巢漿液性癌組織的蛋白表達(dá)明顯高于卵巢漿液性囊腺瘤組織(見圖2)。

2.2 GRP78的表達(dá)與卵巢漿液性癌臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系 GRP78的表達(dá)量與病人的病理分級相關(guān)，GRP78表達(dá)量越高，卵巢漿液性癌病人病理分級程度越高，臨床病理分期分析結(jié)果與病理分級結(jié)果一致。且與低表達(dá)GRP78的卵巢癌病人相比，高表達(dá)GRP78組的病人，糖類抗原125(CA125)指標(biāo)更高。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、盆腔轉(zhuǎn)移、盆腔外轉(zhuǎn)移的比例更高(P<0.01)(見表1)。

2.3 GRP78在HO-8910細(xì)胞和HO-8910PM細(xì)胞中的表達(dá) 結(jié)果顯示，與HO-8910細(xì)胞比較，HO-8910PM細(xì)胞中GRP78的表達(dá)明顯增加(見圖3)。Transwell法檢測結(jié)果表明，與HO-8910細(xì)胞比較，HO-8910PM細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯升高(見圖4～5、表2)(P<0.01)。

表1漿液性卵巢癌臨床指標(biāo)與GRP78的表達(dá)水平的關(guān)系[n；百分率(%)]

項(xiàng)目GRP78表達(dá)量<50%(n=28)GRP78表達(dá)量≥50%(n=32)χ2P年齡/歲 57.57±11.15 60.16±11.34-0.89?>0.05腫瘤直徑/cm11.00±6.1213.54±5.24-1.10?>0.05CA125/(U/mL)144.00±121.25647.31±499.98-5.51?<0.01病理分級 低級 高級20(86.92)8(21.63)3(13.17)29(78.43)24.33<0.01臨床病理分期 Ⅰ、Ⅱ期 Ⅲ、Ⅳ期22(88.01)6(17.12)3(12.04)29(82.93)29.42<0.01淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無 有28(60.93)0(0.02)18(39.17)14(100.01)15.98<0.01盆腔轉(zhuǎn)移 無 有22(91.76)6(16.75)2(8.34)30(83.33)32.54<0.01盆腔外轉(zhuǎn)移 無 無25(62.06)3(15.83)16(38.02)16(84.28)10.650.01

*示t值

2.4 改變GRP78的表達(dá)水平對卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移潛能的影響 在HO-8910細(xì)胞中過表達(dá)GRP78，細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯升高(P<0.01)(見圖6～8、表3)。而在HO-8910PM細(xì)胞中干擾GRP78的表達(dá)，細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯降低(P<0.01)(見圖9～11、表4)。

分組 侵襲細(xì)胞數(shù) 遷移細(xì)胞數(shù)HO-8910細(xì)胞 34.20±8.23 16.60±6.35HO-8910PM細(xì)胞 113.00±14.21 69.40±4.16t -10.73 -15.56P <0.01 <0.01

分組 侵襲細(xì)胞數(shù) 遷移細(xì)胞數(shù) 對照組 34.20±8.23 16.60±6.35 陰性對照組 34.40±9.56 17.80±5.98 pcDNA-GRP78組 108.60±18.89 64.80±10.35F 53.51 61.86P <0.01 <0.01MS組內(nèi) 9 200.867 3 778.067

分組 侵襲細(xì)胞數(shù) 遷移細(xì)胞數(shù) 對照組 111.40±14.28 69.40±4.16 陰性對照組 106.00±6.33 66.40±8.30 shRNA-GRP78組 39.80±8.44 19.80±5.68F 75.70 98.07P <0.01 <0.01MS組內(nèi) 7 948.467 3 867.267

3 討論

正常細(xì)胞在缺氧、酸中毒等應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)產(chǎn)生ERS，ERS可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GRP78含量增加，使細(xì)胞的耐受性增強(qiáng)，保護(hù)細(xì)胞抵抗有害刺激的損傷，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[9]。在腫瘤細(xì)胞中，ERS成為其主要反應(yīng)方式，從而導(dǎo)致GRP78持續(xù)升高，使腫瘤細(xì)胞對缺氧、酸中毒等因素的耐受性增加[10]。GRP78高表達(dá)存在于多種腫瘤中，包括泌尿系、消化系、乳腺、腦和呼吸系統(tǒng)腫瘤等[11]。ZHANG等[12]在消化系統(tǒng)腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，GRP78的表達(dá)升高與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系，并導(dǎo)致病人的不良預(yù)后。使用RNAi技術(shù)定向下調(diào)GRP78表達(dá)，可明顯降低胃癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移能力。同樣在頭頸部腫瘤研究中，CHIU等[13]以RNAi技術(shù)定向基因敲除GRP78在多個(gè)頭頸部鱗癌培養(yǎng)細(xì)胞系中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在基因敲除鱗癌細(xì)胞系中，反映腫瘤轉(zhuǎn)移能力的局部細(xì)胞克隆團(tuán)塊形成能力從53%下降至12%，并且在原位體外腫瘤轉(zhuǎn)移抑制率可達(dá)到67%，抑制肝轉(zhuǎn)移率降低約90%。

本研究檢測了GRP78在卵巢漿液性癌及卵巢漿液性囊腺瘤標(biāo)本中的表達(dá)，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示卵巢漿液性癌組織中GRP78陽性細(xì)胞的比例明顯高于卵巢漿液性囊腺瘤組織。在本研究中，首次觀察到了GRP78表達(dá)量高的卵巢漿液性癌病人，腫瘤分級和臨床病理分期更高，CA125水平更高、腫瘤體積更大。且GRP78表達(dá)量高的病人，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、盆腔轉(zhuǎn)移、盆腔外轉(zhuǎn)移所占比例更高。以上結(jié)果說明GRP78可能為卵巢癌病人重要的預(yù)后因子。

體外研究中，Western blot結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)移潛能低的HO-8910細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移潛能高的HO-8910PM細(xì)胞GRP78表達(dá)明顯升高。在HO-8910細(xì)胞中過表達(dá)GRP78，細(xì)胞發(fā)生侵襲、遷移能力增強(qiáng)；相反，在HO-8910PM細(xì)胞中沉默GRP78可以降低細(xì)胞的侵襲、遷移能力。

本研究僅揭示了GRP78可促進(jìn)卵巢癌的侵襲、遷移，但GRP78如何促進(jìn)卵巢癌的轉(zhuǎn)移尚不清楚。有研究報(bào)道，GRP78的表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的惡性程度呈正相關(guān)關(guān)系，它通過激活FAK及MMP-2促進(jìn)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移[14-15]。在前列腺癌中，GRP78 與活化的α2巨球蛋白結(jié)合，激活 PAK2，導(dǎo)致 LIMK 和 Cofillin磷酸化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；在人畸胎瘤和乳腺癌中，GRP78與 Cripto-1直接結(jié)合，抑制TGF-β介導(dǎo)的Smad2/3磷酸化，激活MAPK/PI3K信號通路，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、 侵 襲 和 轉(zhuǎn) 移；在 結(jié) 腸 癌 中，GRP78與β1- Integrin結(jié)合，活化FAK，激活尿激酶型纖溶酶原，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，調(diào)節(jié)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[16-18]。

總之，該研究揭示了GRP78可以影響卵巢癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，提示GRP78可能是卵巢癌病人重要的預(yù)后因子之一，但還需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和對病人隨訪進(jìn)一步證實(shí)。