張純剛，于琛琛，康 寧，唐靜雅

（1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連 116600； 2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥劑科，遼寧 大連 116011）

白藜蘆醇（RESV）是天然的非黃酮類多酚化合物，主要來源于葡萄、花生、桑椹等，是腫瘤的化學預防劑［1］，也是降低血小板聚集，預防和治療動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學預防劑［2］，廣泛應用于保健品、醫(yī)藥和食品等領域。其水溶性低、穩(wěn)定性差，生物利用度低，在光、熱和氧化劑條件下不穩(wěn)定，易被氧化降解，在一定程度上限制了其應用［3］。因此，開發(fā)安全性高、穩(wěn)定性好的新劑型來提高白藜蘆醇的穩(wěn)定性、水溶性和生物利用度，具有重要臨床意義［4］。因其低溶解度、高滲透性，按生物藥劑學分類為Ⅱ類化合物，其生物利用度主要取決于體外溶出速度［5］。膠束在溶液中，兩親性共聚物可自行組裝成特定的超分子有序聚集體，形成一種穩(wěn)定、澄清的液體制劑，有助于增加藥物的溶解度，提高生物利用度。本研究中根據(jù)白藜蘆醇的性質(zhì)和疏水特性，以泊洛沙姆188為載體，將其制成膠束，以提高白藜蘆醇的水溶性、穩(wěn)定性，并使其半衰期延長，提高生物利用度，擴大其臨床應用。并以原料藥為參比制劑，探討白藜蘆醇膠束在大鼠體內(nèi)的藥代動力學過程?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與動物

儀器：島津LC-2010A型色譜儀（島津色譜工作站，UV檢測器）；AY220型電子分析天平（SHTMADZU公司）；TGL-16 g型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；DAS 3.0軟件（中國藥理學會數(shù)學藥理專業(yè)委員會）；Vortex-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

試藥：白藜蘆醇對照品（含量為98%，南京森貝伽生物科技有限公司，批號為111535-201502）；白藜蘆醇原料藥（武漢遠成賽創(chuàng)科技有限公司）；卡馬西平對照品（含量為99%，上海哈靈生物科技有限公司，批號為100142-201605）；白藜蘆醇膠束（自制）；乙腈（色譜純，天津科密歐科技有限公司）。

動物：取 SD 大鼠 12只，雄性，體質(zhì)量為（250±20）g，由遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號為 SCXK（遼）2015-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

取白藜蘆醇對照品10.2 mg，精密稱定，置250 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為40.8 μg/mL的白藜蘆醇對照品貯備液。

精密稱取白藜蘆醇對照品10.0 mg，精密稱定，與上述同法操作，制成質(zhì)量濃度為40.0 μg/mL的白藜蘆醇質(zhì)量控制貯備液。

取卡馬西平對照品10.1 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.01 mg/mL卡馬西平貯備液。精密量取卡馬西平貯備液，加甲醇稀釋得質(zhì)量濃度為25 μg/mL的內(nèi)標溶液［6］。以上溶液均于4℃冰箱保存，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱：AgilentExtendC18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈 -水（30 ∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：30 μL；檢測波長：320 nm；柱溫：室溫。

2.3 血漿樣品處理［6］

取血漿100 μL，置2 mL離心管中，依次加入10 μL甲醇，10 μL 內(nèi)標溶液，50 μL 0.5% 醋酸，200 μL 乙腈，渦旋混合 60 s，離心 10 min（12000 r/min），取 100 μL上清液置進樣容器中，取30 μL進樣分析。

2.4 方法學考察

專屬性考察：分別取6只大鼠空白血漿，除以甲醇（內(nèi)標溶液的溶劑）替代內(nèi)標溶液外，其余按2.3項下方法操作，得大鼠空白血漿樣品色譜圖（圖1 A）；另取空白血漿、白藜蘆醇樣品和內(nèi)標，及第1只大鼠單次給藥后0.5 h的血漿樣品，按2.3項下方法操作，得模擬樣品及實際樣品色譜圖（圖1 B和圖1 C）。結(jié)果白藜蘆醇的保留時間為3.86 min，內(nèi)標的保留時間為7.25 min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物不干擾白藜蘆醇樣品和內(nèi)標（卡馬西平）的測定。

標準曲線考察和定量限確定：取標準貯備液適量，加空白血漿稀釋成質(zhì)量濃度為 10，20，51，102，204，510，1020，2550 ng/mL 的系列血漿樣品，其余按 2.3項下方法操作，同一質(zhì)量濃度進行雙樣本分析，記錄色譜圖。以血漿中待測物濃度（C，ng/mL）為橫坐標、待測物與內(nèi)標物的峰面積比值（A）為縱坐標，采用加權最小二乘法進行回歸運算，得直線回歸方程［7］。結(jié)果白藜蘆醇質(zhì)量濃度在10～2550 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好，血漿樣品的典型標準曲線回歸方程為Y=0.0057X+0.1068，r=0.9982（n=8），最低定量限（LLOQ）為質(zhì)量濃度10 ng/mL，可滿足SD大鼠體內(nèi)白藜蘆醇測定的要求。

精密度和準確度試驗：精密量取質(zhì)量控制貯備液適量，加空白血漿稀釋成質(zhì)量濃度為低、中、高質(zhì)量濃度（25，400，2040 ng/mL）的質(zhì)量控制（QC）樣品溶液各 6份，連續(xù)測定3 d，除少加甲醇10 μL外，其余按2.3項下方法操作，分別考察日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果見表1?？梢?，方法的準確度與精密度均符合生物樣品分析的要求。

表1 大鼠血漿中白藜蘆醇的準確度和精密度試驗結(jié)果

提取回收率：取空白血漿100 μL，加入白藜蘆醇系列質(zhì)量控制溶液10 μL，配制白藜蘆醇低、中、高質(zhì)量濃度（25，400，2040 ng/mL）的 QC 樣品溶液，除少加甲醇10 μL外，其余按2.3項下方法操作，每一質(zhì)量濃度進行6樣本檢測，得白藜蘆醇相應峰面積，記為A；同時，另取6只大鼠的空白血漿100 μL，除以甲醇10 μL代替相應內(nèi)標卡馬西平的體積外，其余按2.3項下方法操作，再加入相應濃度和體積的白藜蘆醇標準溶液和內(nèi)標溶液，渦流混合，進樣分析，每個質(zhì)量濃度進行3樣本分析，得白藜蘆醇相應峰面積，記為B。以A與B的平均值計算白藜蘆醇的提取回收率，白藜蘆醇在3個質(zhì)量濃度的血漿樣品提取回收率分別為98.13%，97.59%，104.22% （n=3）。依法測得內(nèi)標的提取回收率為101.19%，RSD均在 ±15%以內(nèi)（n=3）。

圖1 血漿中白藜蘆醇和卡馬西平的典型高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗：精密量取質(zhì)控貯備液適量，用空白血漿稀釋成低、中、高質(zhì)量濃度（25，400，2040 ng/mL）的質(zhì)量控制樣品溶液，分別考察白藜蘆醇血漿樣品在室溫放置2 h、白藜蘆醇血漿樣品經(jīng)沉淀蛋白后進樣室溫（4℃）放置24 h、白蘆藜醇血漿樣品-20℃經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)和-20℃冰凍30 d的穩(wěn)定性（相對偏差均在±15%內(nèi)）。3個質(zhì)量濃度未處理，于室溫放置2 h測定含量準確率（RE% ）分別為 5.43% ，8.69% ，-5.50%；白藜蘆醇血漿樣品經(jīng)沉淀蛋白后于室溫（4℃）放置 24 h測得含量 RE%分別為 3.13%，-4.91%，1.04%；反復凍融3次測得含量RE%分別為3.42%，-1.51%，2.89%；-20℃冰凍30 d的穩(wěn)定性測得含量RE% 分別為 1.20% ，-6.68% ，3.39%（RSD均在 ±15%內(nèi)，n=3）。結(jié)果表明，白藜蘆醇血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定性符合要求。

2.5 分析方法在藥代動力學中的應用

2.5.1 給藥方案與樣品采集

取雄性SD大鼠12只，隨機分為A組和B組，各6只。實驗前禁食12 h，自由飲水，次日晨，A組灌胃白藜蘆醇膠束（20 mg/kg），B組灌胃白藜蘆醇原料藥（20 mg/kg）。分別于給藥前（0 h）和給藥后 0.083，0.167，0.25，0.33，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8，12 h 于眼底靜脈叢采血約200 μL，置預先標記好的肝素鈉抗凝管中，4000 r/min離心3 min，分離上層血漿，血漿樣品置-20℃冰箱保存，待測。

2.5.2 統(tǒng)計學處理

2.5.3 藥代動力學研究

實際生物樣品測定過程中，同時配制低（25 ng/mL）、中（400 ng/mL）和高（2040 ng/mL）質(zhì)量濃度的 QC 樣品，根據(jù)當日標準曲線計算未知樣品和QC樣品濃度。經(jīng)測定，12只大鼠分別口服白藜蘆醇膠束和原料藥后獲得平均血漿藥物質(zhì)量濃度-時間曲線見圖2，主要藥代動力學參數(shù)見表2。

圖2 白藜蘆醇在大鼠體內(nèi)的平均血漿藥物濃度-時間曲線對比圖

表2 大鼠體內(nèi)白藜蘆醇主要藥代動力學參數(shù)比較（± s，n=6）

表2 大鼠體內(nèi)白藜蘆醇主要藥代動力學參數(shù)比較（± s，n=6）

注：與白藜蘆醇組比較，aP＜0.05，AUC0-12為 0-12 h下藥 -時曲線下面積；t1/2為生物半衰期；Tmax為達峰時間；Cmax為最大血藥濃度。

參數(shù)AUC0-12 ［ng/（mL/h）］AUC0- ∞ ［ng/（mL/h）］t1/2（h）Tmax（h）Cmax（ng/mL）白藜蘆醇組514.7 ± 117.5543.7 ± 102.22.6 ± 2.00.16 ± 0.07473.3 ± 200.8白藜蘆醇膠束組814.5 ± 174.4a 851.0 ± 226.2a 1.5 ± 0.8a 0.19 ± 0.31082.9 ± 563.6a

大鼠分別灌胃白藜蘆醇原料藥及白藜蘆醇膠束后，白藜蘆醇分別在5 min和15 min左右血藥濃度達峰，說明白藜蘆醇膠束在大鼠體內(nèi)迅速吸收入血。RESV原料藥組最大血藥濃度（Cmax）為（473.3 ±200.8）ng/mL，白藜蘆醇膠束組為（1082.9 ±563.6）ng/mL，提高了 2 倍多（P＜0.05）。與原料藥組相比，膠束組可較快達到有效濃度。與白藜蘆醇原料藥組相比，白藜蘆醇膠束組0～12 h內(nèi)藥-時曲線下面積（AUC0-12）是白藜蘆醇原料藥組的 1.58倍（P＜0.05），即白藜蘆醇組和相對生物利用度為158%。

3 討論

本研究中采用熱熔擠出制劑法制備由功能性輔料泊洛沙姆188與白藜蘆醇組成的藥物制劑，優(yōu)于傳統(tǒng)固體分散體。以泊洛沙姆188為載體將白藜蘆醇制成膠束后能顯著提高白藜蘆醇在大鼠體內(nèi)的生物利用度。

口服制劑出現(xiàn)雙峰的可能原因如下。1）由于胃按一定時間排空，藥物分成2次達到小腸，造成藥物先后入血，出現(xiàn)雙峰；2）藥物在胃腸道的2個部位吸收，有快有慢，因而出現(xiàn)雙峰；3）肝-腸循環(huán)即經(jīng)膽汁或部分經(jīng)膽汁排入腸道的藥物，在腸道中又重新被吸收，經(jīng)門靜脈又返回肝臟；4）制劑原因，如含有速釋成分和緩釋成分；5）脂溶性藥物吸收后，迅速分布到組織中，在血液中藥物代謝到一定程度后，又出現(xiàn)二次入血［8］。由于原料藥組并未出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，僅白藜蘆醇膠束組出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，故可排除機體本身的因素，如吸收部位和肝腸循環(huán)。故考慮制劑的原因可能性較大。此制劑又并未含有速釋和緩釋雙成分，即排除此因素。白藜蘆醇膠束組出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象的原因可能為膠束在胃中析出，排空進入腸中后再次被吸收［7-8］，待進一步研究。