林樂(lè)珍，趙凱麗，杜 坤，黃增瓊

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021）

羅漢松實(shí)為羅漢松科植物羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don 和短葉羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don var.maki Endl.的種子和花托［1］。羅漢松實(shí)具有治心胃痛、血虛面色萎黃、大補(bǔ)元?dú)獾墓πВ?］，主要含降二萜內(nèi)酯類及萜類化合物［3-6］、生物堿類化合物［7］、黃酮類化合物［8］及多糖類、氨基酸、礦物元素和維生素［9］等；其提取物具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、保肝和抗腫瘤等藥理作用［10-12］。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)于北海的羅漢松種子揮發(fā)油中含有大量的川芎嗪，其在揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量高達(dá) 97.27%［7］。本研究中建立了羅漢松種子揮發(fā)油中川芎嗪的含量測(cè)定方法，為建立羅漢松實(shí)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；電子天平，XS-205DU型天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司，十萬(wàn)分之一）；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CD-UPH-Ⅱ-20T型超純水器（成都超純科技有限公司）；萬(wàn)能粉碎機(jī)（無(wú)錫久平儀器有限公司）。

1.2 試藥

羅漢松種子鮮品采自廣西北海，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室李瓊講師鑒定為羅漢松科植物短葉羅漢松P.macrophyllus（Thunb.）D.Don var.maki Endl.的種子；川芎嗪對(duì)照品（上海雅吉生物科技有限公司，批號(hào)為16072405）；甲醇為色譜純，磷酸、石油醚（30～60℃）和無(wú)水硫酸鈉均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

取川芎嗪對(duì)照品約20 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.7572 g/L的對(duì)照品貯備液，精密移取2.0 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.06058 g/L的川芎嗪對(duì)照品溶液。取自然風(fēng)干的羅漢松種子，粉碎，過(guò)20目篩，稱取100g置圓底燒瓶中，加入1000 mL蒸餾水浸泡12 h后，保持微沸蒸餾6 h。餾出液用石油醚萃取3次，每次50 mL，合并醚層，加入無(wú)水硫酸鈉脫水，50℃減壓回收溶劑，得有芳香氣味的淡黃色液體，即為揮發(fā)油；取揮發(fā)油約100 mg，精密稱定，加甲醇超聲溶解并定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。以甲醇為陰性對(duì)照溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：GL Inertsil ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0.1% 磷酸溶液（60 ∶40，V/V），等度洗脫；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：298 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。分別精密吸取 2.1 項(xiàng)下 3 種溶液進(jìn)樣測(cè)定。在此色譜條件下，理論板數(shù)以川芎嗪峰計(jì)大于20000，分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品貯備液0.005，0.010，0.020，0.040，0.050，0.100，0.200，0.300 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，搖勻，定容，即得系列對(duì)照品溶液。按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以川芎嗪進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、相對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=82.182X+11.538，r=0.9998（n=8）。結(jié)果表明，川芎嗪進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.38～22.72 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定川芎嗪的峰面積。結(jié)果的RSD為0.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取揮發(fā)油樣品6份，每份約100 mg，精密稱定，依法制備供試品溶液，并按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果川芎嗪平均含量為117.17 μg/g，RSD為1.60%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1項(xiàng)下供試品溶液，室溫放置0，2，4，8，12，24 h 時(shí)，按 2.2 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果的RSD為0.50%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的揮發(fā)油6份，精密稱定，分別置容量瓶中，各精密加入一定質(zhì)量的川芎嗪對(duì)照品，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取羅漢松實(shí)揮發(fā)油3份，精密稱定，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果 3 份樣品含量分別為 118.35，117.72，116.62 μg/g，平均 117.56 μg/g。

表1 川芎嗪加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 討論

本研究中采用水蒸氣蒸餾法對(duì)羅漢松種子進(jìn)行提取，得淡黃色的揮發(fā)油，提取率為0.18%。在提取揮發(fā)油的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，將種子浸泡一段時(shí)間再蒸餾，可提高揮發(fā)油的提取率?？疾炝朔谐虨?0～60℃和60～90℃石油醚對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果2種石油醚的萃取效果相當(dāng)。此外，萃取劑用量為被萃取液體積的1/2，萃取次數(shù)3次時(shí)，可獲得最佳萃取效果。

經(jīng)紫外掃描發(fā)現(xiàn)，川芎嗪在298 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收，故選擇298 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。在加樣回收試驗(yàn)中，對(duì)照品的加入量對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。選擇川芎嗪含量較高的揮發(fā)油樣品，加入較大量的對(duì)照品，可獲得理想的測(cè)定結(jié)果。經(jīng)測(cè)定，產(chǎn)于北海的羅漢松種子揮發(fā)油中川芎嗪含量為117.56 μg/g，種子中川芎嗪的含量為 0.212 μg/g。

羅漢松種子中含有川芎嗪，而川芎嗪已廣泛用于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病和缺血性腦病的治療［13-14］，故建議將川芎嗪作為羅漢松實(shí)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)成分之一。本研究中建立了羅漢松種子中川芎嗪含量測(cè)定方法，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，分離度和重復(fù)性均良好，可用于羅漢松實(shí)藥材的質(zhì)量控制。