杜曉鵬 郭濤

摘 ? 要：在全面獲取轉(zhuǎn)基因玉米信息的基礎(chǔ)上打造玉米轉(zhuǎn)基因檢測分子特征矩陣，根據(jù)元件信息打造轉(zhuǎn)基因玉米篩查檢測策略，就轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查方法的應用成效問題進行探究，經(jīng)過試驗研究發(fā)現(xiàn)DNA熱堿提取方法和復合PCR技術(shù)結(jié)合能夠提升轉(zhuǎn)基因玉米篩查成效，提升玉米的產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米;快速篩查;方法應用

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究和發(fā)展為玉米的遺傳改良提供了廣闊的發(fā)展前景，篩查法是對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中通用元件進行檢查的方法，具體原理是根據(jù)已知轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的外源插入元件分布情況，挑選出使用頻率最高的幾個外源元件作為檢測指標[1]。如果檢測出任何一個元件，則證明樣品中包含轉(zhuǎn)基因的成本。為此，本文對轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查方法的應用問題進行探究。

1 ? 轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查材料和方法的選擇

1.1 ? 材料和生化試劑

由國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢測測試中心提供BT176和BT11類型的玉米，所有的玉米樣品進行粉碎處理，放置在4℃環(huán)境中保存。

從美國生物系統(tǒng)公司購買配套試劑盒進行樣品的定量反應分析，從北京某科技公司購買種子DNA提取試劑盒、Taq酶、DNA Marker，應用3種不同顏色的熒光劑來標記基因。

1.2 ? 方法

第一，DNA的提取和檢測。DNA提取采取快速提取方法，具體是稱取50mg的玉米粉末樣品，在樣品選擇之后將其放置在1.5mL的離心管中，在離心管中加入20μL的硝酸鈉溶液，震蕩30s之后將離心管放置在沸水中加熱5min。第二，試劑盒法檢測。按照試劑盒內(nèi)部的使用說明書來檢測轉(zhuǎn)基因玉米種子。第三，質(zhì)量檢測。采用1%比例的瓊脂糖凝膠對提取的DNA進行電泳檢測。

2 ? 轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查結(jié)果分析

2.1 ? 轉(zhuǎn)基因玉米種子DNA提取質(zhì)量分析

經(jīng)過試驗比對分析之后發(fā)現(xiàn)，熱堿法提取的DNA和試劑盒提取的DNA相比，所能夠提出的轉(zhuǎn)基因玉米種子DNA數(shù)量較少，且DNA的彌散現(xiàn)象比較嚴重，而出現(xiàn)這種問題的原因是DNA在熱堿的作用下存在不同程度的降解現(xiàn)象[2]。

2.2 ? 打造復合熒光PCR體系

在轉(zhuǎn)基因玉米種子檢測的過程中，為了能夠降低不同引物之間的競爭以及熒光背景對檢測的干擾，可以將3個被檢測基因的引物和探針濃度設(shè)置為3個不同梯度的組合，在對組合優(yōu)化分析之后最終確立3個被檢基因引物及其探針的合適濃度。CaMV353啟動子的引物和探針濃度為200nmol/L，MOS終止子和BAR基因引物最后的濃度為250nmol/L，探針的最終濃度為300nmol/L。

2.3 ? 六重PCR檢測優(yōu)化

在按照規(guī)范方案配比操作的時候，各個基因的擴增效率基本保持在一致的狀態(tài)，但是其他引物濃度梯度結(jié)果不理想。在考慮這些因素之后，最終發(fā)現(xiàn)非特異性條帶的出現(xiàn)不會影響引物濃度梯度試驗對目的條帶的判斷，為此在更進一步試驗操作的時候，需要采取措施對非特異性條帶內(nèi)容進行優(yōu)化處理。同時，從退火溫度梯度檢驗發(fā)現(xiàn)，退火溫度太低會出現(xiàn)特異性的條帶，但是如果退火溫度較高則是會讓不需要的條帶進行理想擴增，由此出現(xiàn)非特異性條帶。確定六重PCR反應體系各個玉米基因引物濃度配合比和退火溫度之后，發(fā)現(xiàn)檢測樣品的擴增條帶與其分子特征顯示的基因元件基本保持在一致的狀態(tài)。在已知樣品中不含有PMI目的基因的時候，擴增的目的基因條帶大小一般在262bp以下，非特異性條帶的大小則是在380bp以上。

綜上所述，玉米是擁有轉(zhuǎn)化體數(shù)量最多的一種作物，多種形式的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體有效豐富了玉米的應用，但是在無形中也增加了對玉米轉(zhuǎn)基因成分的檢測篩查難度。在國內(nèi)，由于沒有批準轉(zhuǎn)基因玉米的商業(yè)化種植，當前玉米的轉(zhuǎn)基因成本檢測主要是針對違規(guī)轉(zhuǎn)基因一系列事件中的樣品檢測。在玉米轉(zhuǎn)基因成分的檢測篩查工作中，為了能夠提升轉(zhuǎn)基因的檢測效率，需要相關(guān)人員借助先進的科技來優(yōu)化試驗方法，在玉米轉(zhuǎn)基因檢測過程中特別是要加強對DNA檢測的關(guān)注。文章在熱堿法快速提取玉米種子胚DNA檢測的基礎(chǔ)上，提出了玉米種子粉末DNA快速檢測方法，有效提升了熒光PCR的靈敏度和擴增特異性能。另外，針對大批量樣品檢測操作煩瑣的問題，還需要相關(guān)人員應用系統(tǒng)來分析轉(zhuǎn)化體的分子特點，對于篩查后表征為陽性的樣品再次進行2次篩查，從而進一步提升轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查效率，并為我國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)督管理提供重要的技術(shù)參考，確保玉米的食用安全、培育安全和生產(chǎn)環(huán)境安全。

參考文獻：

[ 1 ] 吳明生，云曉敏，宋歌，等.轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查方法研究與應用[J].生物技術(shù)通報，2013（1）：102-106.

[ 2 ] 張海波，張英，劉冰，等.玉米中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2015，24（12）：57-63.

（收稿日期：2019-07-12）