馬家璇，蔡 炳，徐艷文，周燦權

（中山大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東 廣州 510080）

胚胎冷凍保存技術從上世紀80年代開始迅速發(fā)展，成為輔助生殖技術的一個重要組成部分。胚胎冷凍可以給新鮮周期移植失敗的以及因各種原因不能進行新鮮胚胎移植的不孕患者或因醫(yī)學原因需要進行生育力保存者提供技術保證。病人經(jīng)過新鮮周期移植后有剩余的優(yōu)質胚胎可以冷凍保存，從一次促排卵治療周期中獲得了多次胚胎移植機會，從而減少了患者促排藥物的使用及取卵手術的次數(shù)，提高了人卵母細胞和胚胎的利用率［1］。然而，對于胚胎冷凍保存的安全性一直存在爭議［2-3］。如 Mozdarani［4］發(fā)現(xiàn)小鼠的胚胎經(jīng)過6個月冷凍后活力下降且出現(xiàn)染色體異常。有的研究［5］則提出相反意見，顯示慢速冷凍保存時長對胚胎復蘇率和妊娠率沒有影響?？紤]到胚胎早期發(fā)育時期正是表觀遺傳調控的關鍵時期，且目前已有多篇研究報道將體外胚胎發(fā)育受到的干擾與表觀遺傳學的影響進行了相關性研究［6-7］，有線索提示胚胎冷凍保存時其所處環(huán)境的劇烈變化有可能導致表觀遺傳修飾出現(xiàn)異常［8］，我們非常關注不同胚胎冷凍保存時長是否會影響到其表觀遺傳修飾。盡管我國胚胎冷凍保存技術已有20多年的歷史，既往也以使用慢速冷凍技術為主，然而仍未見針對慢速冷凍時長對人類正常胚胎的單細胞表觀遺傳影響的研究資料。隨著生育需求的普遍增加，大批冷凍時長在10年以上的胚胎逐漸被解凍移植［9］，從技術的安全性出發(fā)，我們認為有必要開展對保存時長的潛在影響加以研究。本研究使用本生殖中心患者捐獻的不同冷凍保存時長的人類卵裂期胚胎，旨在探討慢速冷凍保存時長對表觀遺傳修飾調控中幾種具有代表性的核心修飾酶的蛋白和mRNA水平的影響，填補該研究領域的空白。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

本研究通過中山大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會審核（批件號：倫審［2018］030號），患者簽署了捐獻卵裂期胚胎作為科學研究的知情同意書。本研究采用的胚胎冷凍保存時長分別為6、9和12年，以新鮮胚胎為對照組，共4組，每組選取來自3位患者、每患者2枚胚胎，即每組共6枚胚胎，每組組內胚胎冷凍保存時間相差小于2個月，所有胚胎凍融前后經(jīng)形態(tài)學評估均為優(yōu)質胚胎（8細胞，細胞均勻，排列緊密，碎片少于20%），胚胎解凍后卵裂球全部存活。研究中涉及的患者的年齡在28到35歲之間，女方不存在單純輸卵管或盆腔因素以外的不孕原因且均為接受卵胞漿內單精子顯微注射技術的患者。

1.2 主要材料

蔗糖Sucrose（美國SIGMA-ALDRICH公司），1%BSA的PBS液（美國GIBCO公司），Triton X-100（美國SIGMA-ALDRICH公司），抗組蛋白［Anti-Histone H3（acetyl K9）antibody］H3K9Ac抗 體（1∶100；英國Abcam公司）、抗去乙?；福ˋntideacetylase HDAC 1antibody）HDAC1抗體（1∶200；英國Abcam公司）、抗組蛋白［Anti-Histone H3（tri methyl K9）antibody］H3K9me3抗體（1∶200；英國Abcam公司）、抗組蛋白［Anti-Histone∶H3（tri methyl K4）antibody］H3K4me3抗體（1∶200；英國Abcam公司），抗兔二抗Alexa Fluor 488（美國Thermo Fisher公司），甲基化酶SUV39H1Taqman引物探針（美國ABI公司），甲基化酶SETDB1 Taqman引物探針（美國ABI公司），去甲基化酶KDM5ATaqman引物探針（美國ABI公司），內參基因GADPH的Taqman引物探針（美國ABI公司），1×TE Buffer（美國ABI公司），單細胞qPCR試劑盒TaqMan Gene Expression Single Cell-to-CT（美國life technology公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 慢速冷凍胚胎解凍胚胎的冷凍方法 使用程序化冷凍儀進行慢速冷凍，參照本中心既往發(fā)表的文章中的方法學描述［10］。解凍時從液氮中取出冷凍胚胎麥管，25℃靜置30 s后，將麥管迅速放入30℃水浴中30 s后取出，剪開麥管，用拉細的巴氏管在體視顯微鏡下迅速找到胚胎，放入胚胎系列解凍液0.5 mol/L Sucrose10 min，0.2 mol/L Sucrose 10 min，0.1 mol/L Sucrose 10 min，HEPES緩沖液10 min，后轉移至vitrolife G系列培養(yǎng)液的囊胚胚胎液G2，置于COOK三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)（體積分數(shù)為5%氧氣、6%二氧化碳、37℃），培養(yǎng)2 h后進行胚胎質量形態(tài)學評分。每組隨機選擇3個胚胎用于免疫熒光染色，另外3個用于實時熒光定量PCR。

1.3.2 免疫熒光染色觀察解凍后的胚胎 使用定量移液槍在胚胎培養(yǎng)皿（Falcon，3002）上制備50 μL左右的試劑微滴，用管口直徑200 μm左右的巴斯德吸管在各滴間進行胚胎轉移。首先將胚胎用含10 g/L BSA的PBS液洗滌3次，每次3 min，0.2%Triton X-100室溫通透 20～30 min，含 1%BSA 的PBS液洗滌3次，每次3 min，使用山羊血清作為封閉液室溫封閉1 h，用10%山羊血清液稀釋的抗組蛋白H3K9ac抗體（1∶100）、抗去乙酰化酶HDAC1抗體（1∶200）、抗組蛋白H3K9me3抗體（1∶200）、抗組蛋白H3K4me3抗體（1∶200），4℃孵育過夜，第2天用含1%BSA的PBS洗滌標本3次，每次3 min，用10%山羊血清液稀釋的二抗Alexa Fluor 488（1∶1 000）室溫避光孵育1 h，用含1%BSA的PBS洗滌3次，每次5 min，最后將洗滌完的標本轉移至載玻片上并使用蓋玻片和中性樹脂封片。在萊卡DMI8熒光顯微鏡下觀察結果并完成拍照，并用OLYMPUS FLUOVIEW 1.7 Viewer圖像處理軟件進行圖像分析。結果以每一種特異性抗體蛋白（H3K9ac、HDAC1、H3K4me3、H3K9me3）的熒光強度除以細胞核DNA的DAPI熒光強度的百分比來表示。使用3pn異常受精胚胎作為陰性對照：將封閉液代替一抗孵育過夜，其他染色步驟相同。

1.3.3 單細胞RT-qPCR檢測 取200 μL的無酶EP管里加入TaqMan Gene Expression Single Cellto-CT Kit中的9 μL Single Cell Lysis Solution，置于冰上。使用巴斯德吸管將收集到的新鮮胚胎、解凍的6、9和12年的胚胎轉入EP管里，后加入1 μL Single Cell DNase I，室溫孵育5 min。最后加入1 μL Stop Solution，在室溫孵育2 min。

逆轉錄及預擴增過程：把TaqMan Gene Expression Single Cell-to-CT Kit中的Single Cell VILO RT Mix 3.0 μL與Single Cell SuperScript RT 1.5 μL和細胞裂解液11 μL混勻，得到15.5 μL反應體系，在基因擴增儀上反應25℃10 min，在42℃60 min，在85 ℃ 5 min。預擴增反應用1×TE Buffer，pH 8.0稀釋目標引物，直到濃度為0.2X。加入TaqMan Gene Expression Single Cell-to-CT Kit中的11 μL 的 PreAmp Mix/pooled TaqManassays，進行熱循環(huán)。1個熱循環(huán)條件如下：在95℃中加熱10 min，然后60℃加熱4 min，最后99℃加熱10 min，后面兩步重復14個循環(huán)。

單細胞qPCR過程：把反應體系在ABI 7500定量PCR儀上行PCR。擴增條件如下：50℃中反應2 min，然后95 ℃ 10 min，60 ℃ 1 min，最后兩步進行40個循環(huán)。記錄各組標本CT值，導出各組在不同目的基因的相對定量數(shù)據(jù)，統(tǒng)計方差大小，在Excel中繪制柱形圖。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（X±S）或中位數(shù)P50（P25～P75）描述，對實驗數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，當數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布及方差齊性時，則多組計量資料的比較采用完全隨機設計多個樣本比較的秩和檢驗即Kruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光檢測不同冷凍時長胚胎H3K9ac、HDAC1、H3K9me3和H3K4me3的差異

在平行實驗條件下，用免疫熒光法檢測不同慢速冷凍時長卵裂期胚胎的組蛋白H3K9ac、去乙?；窰DAC1、組蛋白H3K9me3和組蛋白H3K4me3表達情況。用Image J分析H3K9ac、HDAC1、H3K9me3和H3K4me3在4組之間的灰度，結果提示沒有顯著差異（圖1～4）。

2.2 不同冷凍時長胚胎的SUV39H1、SETDB1和KDM5AmRNA表達量的差異

圖1 新鮮胚胎、慢速冷凍6、9和12年胚胎組蛋白H3K9ac水平Fig.1 The intensity of immunofluorescence of H3K9ac in fresh group，6，9 and 12-year groups

圖2 新鮮胚胎、慢速冷凍6、9和12年胚胎去乙?；窰DAC1水平Fig.2 The intensity of immunofluorescence of HDAC1 in fresh group，6，9 and 12-year groups

在平行實驗條件下，用單細胞RT-qPCR技術檢測不同慢速冷凍時長卵裂期胚胎的甲基化酶SUV39H1、甲基化酶SETDB1和去甲基化酶KDM5A的表達情況（圖5）。甲基化酶SUV39H1對應mRNA的表達量：新鮮組為0.96（0.70～1.49），6年組為 0.54（0.51～0.94），9年組為 0.22（0.14～0.92），12年組為1.40（0.71～1.65），4組之間比較沒有統(tǒng)計學差異（H=5.462，P＞0.05）。甲基化酶SETDB1對應mRNA的表達量：新鮮組為1.01（0.88～1.13），6年組為0.77（0.42～4.64），9年組為 4.18（0.71～5.42），12年組為 4.69（1.16～6.19），4組之間比較沒有統(tǒng)計學差異（H=3.974，P＞0.05）。去甲基化酶KDM5A對應mRNA的表達量：新鮮組為0.84（0.76～1.58），6年組為1.03（0.02～3.40），9年組為7.67（2.75～9.65），12年組為9.88（8.00～10.45），4組之間比較有統(tǒng)計差異（H=8.282，P＜0.05），去甲基化酶KDM5A表達水平在4組之間呈遞增趨勢。

3 討論

過往有理論模型推測胚胎在-196℃的冷凍狀態(tài)下是非常穩(wěn)定的，但現(xiàn)實中會有一些人為因素導致儲存條件出現(xiàn)變動，如多年來反復打開液氮罐取胚胎會影起液氮含量的波動，冷凍時間越長越可能經(jīng)歷更多的溫度波動。有針對冷凍時長對人卵細胞的影響的基礎研究［11-12］，認為冷凍時長對卵子和卵子形成的胚胎無不利影響。其研究樣本為卵子而非胚胎，因此本研究觀察了不同的冷凍保存時長對人類卵裂期胚胎的組蛋白表觀遺傳修飾的影響。

圖3 新鮮胚胎、慢速冷凍6、9和12年胚胎組蛋白H3K9me3水平Fig.3 The intensity of immunofluorescence of H3K9me3 in fresh group，6，9 and 12-year groups

圖4 新鮮胚胎、慢速冷凍6、9和12年胚胎組蛋白H3K4me3水平Fig.4 The intensity of immunofluorescence of H3K4me3 in fresh group，6，9 and 12-year groups

組蛋白H3K9和H3K4的甲基化程度由甲基化酶和去甲基化酶調節(jié)，胚胎植入前階段的甲基化修飾對外界各種影響因素敏感。盡管過去研究曾對組蛋白H3K4me3、組蛋白H3K9me3的功能和調控進行了研究，但目前沒有研究說明長期慢速冷凍保存對人胚胎組蛋白H3K4me3、組蛋白H3K9me3模式的影響。本研究通過免疫熒光技術比較了核心組蛋白H3K4me3和H3K9me3在不同慢速冷凍時長卵裂期胚胎的表達量，結果顯示無統(tǒng)計學差異。

圖5 冷凍保存時長對卵裂期胚胎甲基化酶、去甲基化酶KDM5A的影響Fig.5 The effect of long-time slow-frozen storage on methylase，demethylase KDM5A in cleavage-stage embryos

SETDB1是常染色質主要的組蛋白H3K9甲基轉移酶，在常染色質區(qū)催化組蛋白H3K9的單甲基化（H3K9me）、雙甲基化（H3K9me2），而組蛋白H3K9甲基化與基因沉默有關［13］，因此甲基化酶SETDB1起到抑制轉錄的作用。有學者［14］對牛胚胎早期發(fā)育過程的甲基化酶SETDB1進行抑制，導致組蛋白H3K9me和組蛋白H3K9me2減少，轉錄增強子被激活。因此組蛋白H3K9me3被認為是形成異染色質的主要決定因素，而SUV39家族被認為是催化組蛋白H3K9三甲基化（H3K9me3）形成異染色質的主要決定因素，因此SUV39家族起到抑制轉錄的作用［15］。本研究中甲基化酶SETDB1的mRNA水平在4組之間雖然沒有統(tǒng)計學差異，但是仍可看出隨著冷凍時間增加有上升的趨勢。SETDB1是H3K9的甲基化酶，其增加會導致組蛋白H3K9me1、組蛋白H3K9me2的增加，起到抑制轉錄作用［16］。由于6、9和12年冷凍時長組中甲基化酶SETDB1有增高趨勢，因此H3K9甲基化可能也隨著冷凍時長增加而積累更多，造成胚胎發(fā)育效率低下。

具有JmjC結構域的組蛋白去甲基化酶家族則可催化組蛋白賴氨酸三甲基（me3）發(fā)生去甲基化修飾，KDM5A即是其中一員，是組蛋白H3K4me3的去甲基化酶，由于組蛋白H3K4me3被認為是活性轉錄的標記，通常富集在啟動子，它在轉錄重編程中起著重要的作用［17］，而去甲基化酶KDM5A可以使組蛋白H3K4me1、組蛋白H3K4me2、組蛋白H3K4me3去甲基化，因此去甲基化酶KDM5A也起到抑制轉錄作用［18］。KDM5A的表達水平隨著冷凍時間增加而增加。這與一些學者觀察到慢速冷凍后的胚胎組蛋白H3K4me3等轉錄激活基因表達下降，而一些起抑制作用的組蛋白如H3K27、H3K9me3等則增加的研究結果相符［19］。因此本研究結果提示隨著冷凍時間增加，胚胎的轉錄抑制作用增加，可能阻礙胚胎的早期發(fā)育。

本研究采用免疫熒光的方法檢測了新鮮組、慢速冷凍6、9和12年組的組蛋白H3K9ac與去乙?；窰DAC1。組蛋白H3K9ac大量存在于一些大的啟動子附近，可以通過募集或者激活相關染色體修飾的復合體從而激活基因轉錄。HDAC1是主要的去乙酰化酶，可以使組蛋白H3K9ac去乙酰化，從而導致轉錄抑制狀態(tài)［20］。使用Image J分析4組之間免疫熒光的灰度沒有顯著差異。同時我們用qPCR測4組各自去乙酰化酶HDAC1對應的mRNA表達量，得出結果4組去乙?；窰DAC1對應的mRNA表達量無顯著差異，這個結果提示慢速冷凍胚胎解凍后與新鮮胚胎相比，去乙?；窰DAC1以及組蛋白H3K9ac沒有受到影響。該結果與另外一些學者得出的研究結果不同［21］，這有可能是由于研究的胚胎來源物種不同，以及解凍的方法或者冷凍操作過程與其不一樣導致。實驗結果還顯示冷凍時長6、9和12年這3個實驗組之間的結果也相近，提示慢速冷凍時長在成功復蘇的優(yōu)質胚胎的組蛋白乙?；揎椛系挠绊懖⒉伙@著。

總之，去甲基化酶KDM5A表達水平在3個冷凍時長組中隨著冷凍時間增加而增加，明顯起到抑制轉錄作用。因此本研究結果提示隨著冷凍時間增加，胚胎的轉錄抑制作用增加，可能阻礙胚胎早期發(fā)育。同時甲基化酶SETDB1也是隨著冷凍時間增加，雖然沒有統(tǒng)計學差異，但仍可看出有上升趨勢，甲基化酶SETDB1可以使組蛋白H3K9me3積累，這個也可能會造成胚胎發(fā)育效率受到影響。本研究結果提示我們需要重視胚胎長時間冷凍保存可能存在的問題，因此臨床上利用過長時間保存的胚胎時應特別重視其安全性以及子代的健康。但是由于本研究的樣本量較少，其結論仍需要更多研究證據(jù)進一步加以證實，進一步的深入研究是很有必要的。