王 芍，許苗苗，王舒懿，謝志民

0 引言

中藥急救有三寶，“乒乒乓乓紫雪丹、不聲不響至寶丹、稀里糊涂牛黃丸”口口誦傳，其中的至寶丹就是局方至寶丸，對(duì)于昏迷伴發(fā)熱，不聲不響即神智不清的溫病感染性和傳染性疾病的患者，具有良好的效果。局方至寶丸由水牛角、人工牛黃、玳瑁、琥珀、麝香、安息香、朱砂、雄黃、冰片組成[1]，其中雄黃作為局方至寶丸的佐藥，主要成分是As2S2，中國(guó)藥典規(guī)定雄黃中的As2S2含量不得低于90.0%[2]，其不溶于水，在人的胃腸道中難以吸收，幾乎沒(méi)有毒性[3-4]。但藥材中常含有水溶性的砷鹽或As2O3，均為劇毒成分，故服用含雄黃的制劑，有毒副作用及導(dǎo)致砷中毒的報(bào)道[5-8]。目前雄黃的炮制，多采用機(jī)械化(球磨機(jī))干法研磨，這種加工過(guò)程中所產(chǎn)生的熱，不僅不能除去可溶性砷鹽，還可能使As2S2因受熱氧化成As2O3，或因鋅、碳存在的情況下，還原成單質(zhì)砷，增加了雄黃粉的毒性，是導(dǎo)致雄黃中毒的主要原因[9]。藥典對(duì)雄黃和雄黃粉末中As2O3進(jìn)行了限度規(guī)定，雄黃傳統(tǒng)的和藥典規(guī)定的炮制方法是水飛法，目的是為了減少雄黃粉末中水溶性砷鹽或As2O3，以降低毒性。為了控制成藥毒性，本實(shí)驗(yàn)研究雄黃中可溶性砷含量測(cè)定方法，作為局方至寶丸中雄黃的質(zhì)量控制手段之一，為臨床安全用藥提供理論支持。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 原子吸收分光光度儀(Thermo iCE3000 SERIES)，超純水機(jī)(Millipore Milli-Q)。

1.2 試藥 硝酸(65%)為色譜純級(jí)(Merck & Co Inc)，水為超純水；鹽酸、氫氧化鈉、硼氫化鈉、抗壞血酸、碘化鉀等均為分析純。砷元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW08611-15105，含量：1 000 μg/ml)，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。局方至寶丸(廠家：北京同仁堂制藥廠，批號(hào)：3010201、3010203、3010204)。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器條件 采用氫化物發(fā)生-原子吸收法測(cè)定局方至寶丸中水溶性砷鹽的含量，具體原子吸收儀器工作條件見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密量取1 ml砷單元素標(biāo)準(zhǔn)液(1 000 μg/ml)，置100 ml量瓶中，加2%鹽酸稀釋至刻度制成對(duì)照品儲(chǔ)備液(100 ng/ml)。精密吸取儲(chǔ)備液0、1、2、3、5、10 ml，分別置25 ml量瓶(聚乙烯)中，加2%鹽酸稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液(濃度分別為0、4、8、12、20、40 ng/ml)。

表1 原子吸收儀器條件

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取上述各濃度的對(duì)照品溶液各10 ml，分別置25 ml量瓶(聚乙烯)中，分別加1 ml 25%碘化鉀溶液(臨用前配制)，混勻，再加1 ml 10%抗壞血酸溶液(臨用前配制)，混勻，用鹽酸溶液(20→100)稀釋至刻度，混勻，密塞，加熱3 min(80 ℃水浴)，取出，放冷，作為砷對(duì)照品測(cè)定溶液0號(hào)(0 ng/ml)、1號(hào)(1.6 ng/ml)、2號(hào)(3.2 ng/ml)、3號(hào)(4.8 ng/ml)、4號(hào)(8 ng/ml)、5號(hào)(16 ng/ml)。取適量吸入氫化物發(fā)生器，以1%鹽酸溶液為載液，含1%硼氰化鈉和臨用前配制的0.3%氫氧化鈉溶液作為還原劑，惰性氣體氬氣為載氣，測(cè)定193.7 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸方程計(jì)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.007 53X+0.009 3(r=0.995 5)。結(jié)果表明,砷元素對(duì)照品在0～16 ng/ml濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.4 儀器精密度考察 取上述對(duì)照品溶液1、3、5號(hào)，按照上述方法重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果低、中、高3個(gè)濃度的測(cè)量RSD分別為6.67%、2.88%、2.55%，顯示儀器精密度良好。

2.5 供試品溶液制備方法的考察 精密稱取局方至寶丸(批號(hào)：3010201)與等量硅藻土混合粉末0.1 g共9份和硅藻土粉末50 mg 9份(作為每份樣品的空白)，置具塞錐形瓶中，分別精密加入2%鹽酸50 ml，按正交表L9(33)要求，以砷的測(cè)得量為指標(biāo)，選取超聲時(shí)間、加入的碘化鉀量和抗壞血酸量為考察因素(表2)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

取適量溶液吸入氫化物發(fā)生器，以1%鹽酸溶液為載液，含1%硼氰化鈉和臨用前配制的0.3%氫氧化鈉溶液作為還原劑，惰性氣體氬氣為載氣，測(cè)定193.7 nm波長(zhǎng)的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)表3。進(jìn)行分析處理，最佳提取方法為取供試品超聲處理(功率240 W，頻率40 kHz)30 min，離心10 min(3 500 r/min)，精密量取上清液2 ml，置100 ml聚乙烯量瓶中，加2%鹽酸至刻度，搖勻，精密量取10 ml，置25 ml聚乙烯量瓶中，加25%碘化鉀溶液1 ml，搖勻，再加10%1 ml抗壞血酸溶液，搖勻，用鹽酸溶液(20→100)稀釋至刻度，搖勻，密塞，置80 ℃水浴中加熱3 min，取出，放冷。

2.6 重復(fù)性考察 精密稱取局方至寶丸(批號(hào)：3010203)與等量硅藻土混合粉末6份，每份精密稱取0.1 g，按照“2.5”項(xiàng)下優(yōu)選方法測(cè)定水溶性砷的含量，6份樣品測(cè)定結(jié)果的RSD為4.4%。結(jié)果表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性考察 取重復(fù)性1號(hào)供試品儲(chǔ)備溶液，按上述方法制成供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12 h測(cè)定吸光度，計(jì)算變異系數(shù)，RSD為4.2%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取局方至寶丸(批號(hào)：3010203)和硅藻土研勻的粉末50 mg，分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)砷8、16、24 μg，置具塞錐形瓶中，分別精密加入2%鹽酸50 ml，按照“2.5”項(xiàng)下優(yōu)選方法制備供試品，并測(cè)定吸收值(見(jiàn)表4)，加樣回收率為99.25%，RSD(n=9)為1.74%。

2.9 方法的檢測(cè)限、定量限考察和樣品測(cè)定 按響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法計(jì)算檢測(cè)限LOD=3.3 δ/S=6.2 μg/g、定量限LOQ=10 δ/S=18.8 μg/g。取3批局方至寶丸(批號(hào)：3010201、3010203、3010204)樣品，按“2.5”項(xiàng)下優(yōu)化方法制備樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定其水溶性砷的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 通過(guò)樣品測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，局方至寶丸中可溶性砷含量偏高，分析原因可能是雄黃的炮制方法不當(dāng)[10-11]，故筆者從藥材市場(chǎng)買來(lái)雄黃藥材，對(duì)其進(jìn)行研磨和水飛兩種方式炮制，并和市售的雄黃粉末共同作為樣品，按照本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的提取檢測(cè)條件進(jìn)行可溶性砷測(cè)定，結(jié)果顯示，雄黃藥材研磨粉末含量為1.87%，雄黃藥材水飛粉末含量為0.51%，市售雄黃粉末含量為1.51%，水飛雄黃中可溶性砷的含量約為研磨成粉雄黃的1/3，同時(shí)市場(chǎng)上存在不按規(guī)范炮制的雄黃粉末。結(jié)果提示，炮制方法的不規(guī)范成為安全用藥的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，警示我們應(yīng)對(duì)成藥中的可溶性砷進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而監(jiān)督雄黃的正確炮制和投料，從而保證含雄黃制劑的安全性。

表3 供試品溶液制備方法的考察結(jié)果

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表5 3批樣品測(cè)定結(jié)果(mg/丸，n=3)

3.2 中成藥以中藥材為原料，運(yùn)用現(xiàn)代制劑工藝加工而成，由于歷史和使用人文環(huán)境的因素，傳統(tǒng)中藥不太注重對(duì)于不良反應(yīng)的研究，說(shuō)明書大多不完善[12]。局方至寶丸現(xiàn)行的說(shuō)明書不良反應(yīng)項(xiàng)為尚不明確，而依本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，砷中毒有可能成為其不良反應(yīng)中的1項(xiàng)，特別是在小兒用藥期間，由于小兒肝腎功能發(fā)育不全，應(yīng)對(duì)其尿砷、血砷含量進(jìn)行監(jiān)控，達(dá)到中病即止，不要超范圍、超劑量用藥。同時(shí)對(duì)臨床出現(xiàn)的不良反應(yīng)加以統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)其說(shuō)明書要及時(shí)修訂，補(bǔ)充和完善相關(guān)內(nèi)容，為臨床合理使用及藥品的管理提供依據(jù)。

3.3 本實(shí)驗(yàn)存在的不足之處：影響中藥安全性評(píng)價(jià)的因素很多，如中藥作用多途徑、化學(xué)成分繁多，有效成分不明確，配伍多樣性，作用機(jī)制和毒理機(jī)制的復(fù)雜性，這些都制約了中藥走出國(guó)門，被世界所認(rèn)可，但是中藥經(jīng)歷了數(shù)千年的臨床實(shí)踐，有效性真實(shí)存在，故找出影響中藥安全性的物質(zhì)基礎(chǔ)是當(dāng)務(wù)之急。本次實(shí)驗(yàn)只是對(duì)局方至寶丸中有害成分-可溶性砷的總量進(jìn)行了測(cè)定，由于實(shí)驗(yàn)條件環(huán)境的限制，沒(méi)有進(jìn)行體內(nèi)外模擬實(shí)驗(yàn)，沒(méi)有對(duì)服用局方至寶丸的患者進(jìn)行血砷和尿砷的測(cè)定，無(wú)法反映局方至寶丸中可溶性砷鹽在人體的吸收分布和代謝情況。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以為日后局方至寶丸的臨床用藥評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支持，促進(jìn)其安全用藥。