(梅花生物技術(shù)開(kāi)發(fā)(廊坊)有限公司，河北 廊坊 065001)

核苷酸是組成核酸的基本單位，由磷酸、戊糖和堿基組成。戊糖與堿基通過(guò)糖苷鍵形成核苷，核苷與磷酸通過(guò)酯鍵形成核苷酸。呈味核苷酸包括肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸、胞苷酸、尿苷酸以及黃苷酸，后三者的呈味力遠(yuǎn)不及前兩者，因此工業(yè)生產(chǎn)上的呈味核苷酸主要為肌苷酸(IMP)和鳥(niǎo)苷酸(GMP)。研究表明：IMP和GMP的呈味作用取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)，只有核苷5′-位上的-OH與磷酸基團(tuán)發(fā)生酯化才表現(xiàn)出鮮味活性，而2′-和3′-位上的-OH磷酸酯化無(wú)鮮味[1]。按照n(IMP)∶n(GMP)=1∶1混合，鮮味閥值(能感覺(jué)出鮮味的最低濃度)可降至0.006 3%。核苷酸為白色或米黃色結(jié)晶或粉末，無(wú)臭，味鮮，溶于水，微溶于乙醇，幾乎不溶于乙醚，干燥狀態(tài)下，耐熱性較好，在水溶液中，其穩(wěn)定性與溫度和pH有關(guān)[2]。1960年，日本的KUNINAKA博士發(fā)現(xiàn)5′-鳥(niǎo)苷酸具有鮮味，且在香菇中的含量較高，隨后利用從桔青霉(Penicilliurncitrinum)中提取的5′-磷酸二酯酶降解RNA生成5′-核苷酸[3]。日本利用該方法開(kāi)始了核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn)[4]。目前，應(yīng)用較為廣泛的核苷酸生產(chǎn)方法主要有微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法、酶解法和生物催化法。

1 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法主要是利用微生物的代謝途徑生產(chǎn)呈味核苷酸，其代謝途徑和調(diào)節(jié)機(jī)制是發(fā)酵法的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。

肌苷酸直接發(fā)酵法采用的生產(chǎn)菌株是產(chǎn)氨短桿菌突變株KY13105。在0.01～0.02 mg/L的Mn2+質(zhì)量濃度下，細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，胞內(nèi)可累積肌苷酸。Mn2+質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，其合成代謝的過(guò)程將會(huì)被抑制。開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)，次黃嘌呤在胞外累積，經(jīng)過(guò)磷酸化反應(yīng)生成5′-肌苷酸，但是在發(fā)酵的中后期，5′-肌苷酸直接在細(xì)胞內(nèi)生成，并釋放到細(xì)胞外，不必經(jīng)過(guò)細(xì)胞外的磷酸化反應(yīng)過(guò)程。日本研究人員誘變篩選后得到一株腺嘌呤滲漏缺陷型產(chǎn)氨短桿菌，產(chǎn)酸積累量最高可以達(dá)到12.8 mg/mL[5-8]。

肌苷酸間接發(fā)酵法是利用發(fā)酵法和化學(xué)法(或生物催化法)相結(jié)合的方法。利用短小芽孢桿菌、枯草桿菌和產(chǎn)氨短桿菌進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵的方式生產(chǎn)肌苷。提取得到肌苷，經(jīng)過(guò)化學(xué)法磷酸化生產(chǎn)IMP，或者通過(guò)發(fā)酵法得到腺嘌呤或5′-AMP，再通過(guò)化學(xué)法或生物催化法轉(zhuǎn)化為IMP。

鳥(niǎo)苷酸發(fā)酵法可分為直接發(fā)酵法和間接發(fā)酵法。利用枯草芽孢桿菌直接發(fā)酵生產(chǎn)鳥(niǎo)苷酸時(shí)，鳥(niǎo)苷酸不會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累，導(dǎo)致產(chǎn)量較低。菌種的誘變要考慮反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，還要控制微生物中的相關(guān)酶系，技術(shù)上的難題尚未解決，大規(guī)模生產(chǎn)的困難較大。間接法是采用發(fā)酵法和化學(xué)合成法相結(jié)合，通過(guò)從枯草桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)AICAR(5-氨基-4-咪唑基羧基酰胺核苷)，然后再通過(guò)化學(xué)法得到鳥(niǎo)苷酸，收率可達(dá)到60%～70%。盛翠[9]通過(guò)紫外誘變BacillussubtilisJSIM-G518菌株，阻止鳥(niǎo)苷代謝為鳥(niǎo)嘌呤，解除終產(chǎn)物的遏制，最終得到產(chǎn)量較高的突變菌株JSIM-GU-124-19，發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到24.0 g/L；武改紅[10]通過(guò)硫酸二乙酯(DES)和紫外誘變枯草芽孢桿菌TA1001，定向選育出一株具備工業(yè)化生產(chǎn)潛力且遺傳性狀穩(wěn)定的突變株TA208，在未經(jīng)優(yōu)化的搖瓶發(fā)酵條件下可產(chǎn)鳥(niǎo)苷15.82 g/L，將得到的鳥(niǎo)苷通過(guò)化學(xué)法制得鳥(niǎo)苷酸。

直接發(fā)酵法制備5′-核苷酸一般分為發(fā)酵放罐，去除菌體，脫色濃縮，分離烘干等工藝流程得到成品。微生物直接發(fā)酵法副產(chǎn)物少，成本低，提取工藝簡(jiǎn)單易行，但此法的應(yīng)用受微生物特性的限制較大，而且產(chǎn)量較低，一般采用間接發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷或鳥(niǎo)苷，利用化學(xué)法生產(chǎn)5′-呈味核苷酸。

2 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法是以肌苷或鳥(niǎo)苷為原料，通過(guò)磷酸酯化反應(yīng)獲得核苷酸。常用的磷酸化試劑主要是一氯或二氯磷酸衍生物，在核苷的5′位的羥基上特定轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)，使其磷酸化得到5′-呈味核苷酸。由于核苷上核糖的2′，3′位存在羥基，因此，在磷酸酯化前，需要以適當(dāng)?shù)姆椒ūＷo(hù)其不被酯化。繁復(fù)的生產(chǎn)步驟使得生產(chǎn)成本增加，產(chǎn)率下降[11]。

隨著技術(shù)革新，P2O5或POCl3成為新型磷酸化試劑。核苷可以不用任何保護(hù)劑，直接進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，且轉(zhuǎn)化率較高[12]。以POCl3為磷酸化供體，肌苷和鳥(niǎo)苷的轉(zhuǎn)化率分別可達(dá)到91%和90%[13]。此方法也適用于許多非天然核苷酸的合成。但是，當(dāng)?shù)孜锇瑢?duì)酸不穩(wěn)定的基團(tuán)時(shí)，效果較差[14]。

梅花生物公司采用此種方法生產(chǎn)5′-核苷酸，以磷酸三乙酯作為溶劑，POCl3與肌苷或鳥(niǎo)苷反應(yīng)生成5′-核苷酸。經(jīng)過(guò)水解、萃取、中和、分離、脫色以及結(jié)晶等工序，得到5′-呈味核苷酸。工藝流程如圖1所示。

圖1 化學(xué)合成法制備5′-核苷酸工藝流程Fig.1 Preparation of 5′- nucleotide by chemical synthesis process

化學(xué)合成法優(yōu)勢(shì)在于專一性強(qiáng)，副產(chǎn)物少。但是呈味核苷酸的極性較強(qiáng)，提取工藝較復(fù)雜；化學(xué)反應(yīng)所涉及的化學(xué)原料POCl3毒性較大，對(duì)人體及環(huán)境有危害，且生產(chǎn)試劑昂貴，成本偏高。

3 酶解法

通過(guò)酶制劑水解細(xì)胞內(nèi)RNA得到目的核苷酸的方法稱為酶解法，歷史悠久，相關(guān)研究較為深入，已成為制備呈味核苷酸的經(jīng)典方法。一般情況下，核酸水解酶可以分為3類，主要有RNA水解酶、DNA水解酶、以及DNA和RNA都能作用的核酸水解酶。前兩種水解酶價(jià)格昂貴，主要用于實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)研究[15]。20世紀(jì)60年代，日本首次通過(guò)酶解法，利用P.citrinum提取的5′-磷酸二酯酶，降解RNA生成5′-核苷酸。酶解法是生產(chǎn)5′-核苷酸是歷史最長(zhǎng)、技術(shù)最成熟的生產(chǎn)方法。我國(guó)從1964年開(kāi)始研究RNA的酶解法，1967年中試，試驗(yàn)基本取得成功。

酶解法可分為酶液直接水解法和固定化酶水解法。李德瑩等[16]采用直接酶解法，用麥芽根浸提液作為酶液，酶解2 h的水解率可達(dá)80%；慕娟[17]報(bào)道核糖核酸(RNA)在麥芽根作用下水解為單核苷酸。

我國(guó)于1970年將固定化核酸酶應(yīng)用于5′-核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn)。固定化核酸酶則具有成本低廉、核酸降解率穩(wěn)定、利于核苷酸分離、精制、設(shè)備要求不高等優(yōu)點(diǎn)。Olmedo等[18]使用環(huán)氧乙烷活化丙烯酸樹(shù)脂固定核酸酶P1，使該酶的選擇性和米氏常數(shù)提高；石陸娥[19]研究認(rèn)為將核酸酶P1固定在殼聚糖微球上，熱穩(wěn)定性和存儲(chǔ)穩(wěn)定性以及耐酸堿性有明顯提高；梁鋒等[20]報(bào)道原酶經(jīng)過(guò)鈦氯活化纖維固定，回收活力超過(guò)70%；王克明等[21]報(bào)道將桔青霉的孢子吸附在玉米芯上，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的海藻酸鈉包埋玉米芯顆粒，采用氣升式反應(yīng)器固定化技術(shù)生產(chǎn)核酸酶P1，發(fā)酵液中核酸酶P1的活力高達(dá)8.43 mmol/(sL)。固定核酸酶的載體來(lái)源廣泛、制備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，且固定化后的酶不用回收。

除固定化酶生產(chǎn)核苷酸外，膜反應(yīng)器法亦可實(shí)現(xiàn)RNA連續(xù)水解生產(chǎn)核苷酸，為生產(chǎn)呈味核苷酸提供了新的思路。邵晶平等[22]發(fā)明了一種超濾膜反應(yīng)器，由核RNA連續(xù)酶水解生產(chǎn)5′-核苷酸。該方法將酶水解和產(chǎn)物同步分離，操作簡(jiǎn)捷，無(wú)須固定化。弊端在于雖然能提高水解效率，但膜設(shè)備和膜材料再生處理費(fèi)用較高，而且比較麻煩，目前這種方法只能用于醫(yī)藥核苷酸的生產(chǎn)。3種水解法的優(yōu)勢(shì)與弊端對(duì)比見(jiàn)表1。

表1 3種酶解法對(duì)比表Table 1 Comparison table of three enzymatic hydrolysis methods

4 生物催化法

生物催化法即核苷磷酸化法，是模擬生物體內(nèi)的條件，利用活性微生物攜帶的酸性磷酸酶，將聚磷酸鹽上的磷酸根特異性地轉(zhuǎn)移到核苷分子的特定位置上的方法。研究人員從MorganellamorganiiNC IMB10466中提取出一種可以將核苷磷酸化的酸性磷酸酶。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，酸性磷酸酶具有磷酸轉(zhuǎn)移催化的特定選擇性[28-31]，該反應(yīng)不需要ATP，反應(yīng)條件溫和，無(wú)需保護(hù)基團(tuán)，而且磷酸酶具有專一性強(qiáng)，環(huán)境友好等特點(diǎn)，其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力吸引著研究人員的關(guān)注[25-28]。該方法可用于制備呈味核苷酸，且具有以上3種方法無(wú)法比擬的優(yōu)越特性。

生物催化的基本過(guò)程：在磷酸酶的作用下，肌苷/鳥(niǎo)苷與聚磷酸鹽反應(yīng)生成IMP/GMP和正磷酸鹽，經(jīng)過(guò)等電、分離、脫色、結(jié)晶、烘干等步驟得到5′-呈味核苷酸，如圖2所示。

圖2 生物催化法制備5′-核苷酸工藝流程圖Fig.2 Preparation of 5′-nucleotide by biocatalysis process

研究人員分離出控制磷酸轉(zhuǎn)移作用的活性基因，誘發(fā)后篩選出一株富產(chǎn)酸性磷酸酶的變異株，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到85%。李文峰等[32]以肌苷轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，在全細(xì)胞工程菌的催化作用下，肌苷轉(zhuǎn)化為肌苷酸，并考察了PEG，對(duì)異辛基苯基醚，Trion-x-100，DMSO和硼酸對(duì)肌苷反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響，肌苷的摩爾轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)到75%；日本味之素利用三聚磷酸鈉提供磷酸基團(tuán)，在pH為4.5，溫度35 ℃的條件下，制備出呈味核苷酸二鈉，并指出pH是影響轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素，通過(guò)調(diào)節(jié)pH將反應(yīng)后殘留的正磷酸進(jìn)行回收并再縮合，再次作為酶解反應(yīng)的原料，提高磷酸化收率和磷酸使用率[33]；任洪發(fā)[34]采用酸性磷酸酶催化肌苷轉(zhuǎn)化為5′-肌苷酸二鈉，分別對(duì)過(guò)濾清液中磷酸鹽混合物、5′-肌苷酸二鈉和肌苷進(jìn)行了結(jié)晶工藝研究，確定了優(yōu)選結(jié)晶工藝條件，按照優(yōu)選條件進(jìn)行了中試驗(yàn)證，結(jié)晶產(chǎn)品完全符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。酸性磷酸酶既可以轉(zhuǎn)移磷酸根合成核苷酸，又可以將核苷酸水解。因此，在反應(yīng)過(guò)程中需要注意控制條件，同時(shí)酶的底物作用范圍也有一定的限制。針對(duì)這一特點(diǎn)，研究人員誘變并篩選以催化磷酸轉(zhuǎn)移為主導(dǎo)的菌株，希望能抑制這種酶的水解作用。這一發(fā)現(xiàn)為生物催化法生產(chǎn)呈味核苷酸提供了新途徑，使得該方法具有很大的發(fā)展空間。

5 結(jié) 論

呈味核苷酸在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)行業(yè)領(lǐng)域中有廣泛的用途。微生物發(fā)酵法副產(chǎn)物少，成本低，但此法的應(yīng)用受到微生物特性的很大限制；化學(xué)合成法專一性強(qiáng)，副產(chǎn)物少，但是化學(xué)原料毒性大，對(duì)人員及環(huán)境危害較大，而且后續(xù)提取工藝復(fù)雜，成本較高；酶解法歷史悠久，研究較為深入，已成為制備呈味核苷酸的經(jīng)典方法；生物催化法專一性強(qiáng)，磷酸供體來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，提取工藝較為簡(jiǎn)單，原料對(duì)環(huán)境友好，吸引著越來(lái)越多研究人員的關(guān)注。我國(guó)在呈味核苷酸方面的研究時(shí)間較短，在工藝研發(fā)和優(yōu)化等方面還有很長(zhǎng)的路要走，未來(lái)在核苷酸領(lǐng)域必將獲得更大的發(fā)展。