(山東阜豐發(fā)酵有限公司，山東 臨沂 276600)

酸性乳飲料酸甜適中，爽滑可口，既具備了酸奶的特殊風(fēng)味，又包含了酸奶的大部分營(yíng)養(yǎng)成分和功能，且價(jià)格便宜，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。為滿足消費(fèi)者對(duì)酸性乳飲料日益增長(zhǎng)的需求，乳制品企業(yè)致力于開發(fā)形式多樣的酸性乳飲料產(chǎn)品。但是由于酪蛋白在酸性乳飲料生產(chǎn)過程中易聚合，導(dǎo)致產(chǎn)品在貯存過程中發(fā)生分層、絮凝，帶來蛋白質(zhì)沉淀問題，影響產(chǎn)品品質(zhì)[1]，給生產(chǎn)廠家?guī)砗艽蟮睦_，一直制約著酸性乳飲料產(chǎn)品的生產(chǎn)和開發(fā)。

添加穩(wěn)定劑可以有效解決酸性乳飲料中蛋白質(zhì)絮凝沉淀的問題。其中，應(yīng)用最廣泛的穩(wěn)定劑是CMC[2]，單獨(dú)使用CMC可以達(dá)到產(chǎn)品穩(wěn)定的效果，但產(chǎn)品的口感和風(fēng)味欠佳，加入黃原膠可以給產(chǎn)品帶來更爽滑的口感，但黃原膠與CMC復(fù)配導(dǎo)致產(chǎn)品穩(wěn)定性波動(dòng)很大[3]，限制了黃原膠在酸性乳飲料行業(yè)中的應(yīng)用。目前，尚未見通過改性黃原膠，使其與CMC復(fù)配使用得到穩(wěn)定性好、口感好的酸性乳飲料的文獻(xiàn)資料報(bào)道。筆者通過對(duì)復(fù)配穩(wěn)定性好的酸性乳飲料專用型黃原膠(下稱專用型)和普通黃原膠進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)，找到了二者之間的差別；通過改變發(fā)酵和提取工藝，達(dá)到對(duì)黃原膠進(jìn)行改性處理的目的；得到的黃原膠與CMC復(fù)配應(yīng)用于酸性乳飲料中，不會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)品分層和絮凝沉淀的現(xiàn)象，使產(chǎn)品穩(wěn)定性得到了很大的改善。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃原膠：市售普通型和專用型。分別編號(hào)為US-01，US-02，F(xiàn)R-01，F(xiàn)R-02，CN-01和CN-02。其中US為美國(guó)產(chǎn)，F(xiàn)R為法國(guó)產(chǎn)，CN為國(guó)產(chǎn)。US-01和FR-01為酸性乳飲料專用型黃原膠，其他為普通黃原膠。

菌種：甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌；KCl，NaOH，CaCO3和鹽酸均購(gòu)于天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；食品級(jí)乙醇(體積分?jǐn)?shù)為95%)、葡萄糖、脫脂奶粉、羧甲基纖維素鈉(CMC)、山梨酸鉀、檸檬酸均為市售普通食品和食品添加劑、加工助劑；蛋白胨、酵母粉、瓊脂等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC，美國(guó)安捷倫公司；原子吸收光譜儀，北京普析通用儀器有限公司；電子天平，梅特勒-托利多(METTLER TOLEDO)；pH計(jì)，上海雷磁科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱、搖床：上海一恒儀器有限公司；Brookfield黏度計(jì)，美國(guó)Brookfield公司；立式壓力蒸汽滅菌器、電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；其他實(shí)驗(yàn)儀器購(gòu)自蜀牛玻璃儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃原膠特殊基團(tuán)(丙酮酸和乙?；?質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參考GB 1886.41—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 黃原膠》中丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法；乙酰基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參考文獻(xiàn)[4]中的方法；對(duì)黃原膠進(jìn)行處理，獲得試樣進(jìn)行液相分析。

1.3.2 金屬離子含量測(cè)定

鉀和鈉離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參照GB 5009.91—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉀、鈉的測(cè)定》中第一法；鎂離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參照GB 5009.241—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎂的測(cè)定》中第一法；鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參照GB 5009.92—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測(cè)定》中第一法。

1.3.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

將冷凍菌種活化后接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h，按5%的接種量(體積分?jǐn)?shù))接入250 mL搖瓶中(瓶?jī)?nèi)加60 mL原始發(fā)酵培養(yǎng)基[5])，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min，30 ℃培養(yǎng)72 h。以原始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，應(yīng)用單因素優(yōu)化方法，以發(fā)酵液產(chǎn)膠率(每千克發(fā)酵液獲得的黃原膠干物質(zhì)質(zhì)量)、發(fā)酵液黏度、Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)對(duì)CaCO3的添加量進(jìn)行優(yōu)化。CaCO3的添加量分別設(shè)定為0，0.1‰，0.2‰，0.3‰，0.4‰和0.5‰(以培養(yǎng)基計(jì))。采用NaOH調(diào)節(jié)pH。

1.3.4 提取過程優(yōu)化

采用乙醇沉淀的方式對(duì)黃原膠進(jìn)行提取。因?yàn)樾枰谒嵝原h(huán)境下將丙酮酸去除，故在單因素實(shí)驗(yàn)中將條件假設(shè)為pH 4.0，溫度40 ℃，時(shí)間2 h；保溫完成后，將黃原膠倒出，加入1 000 mL乙醇，用NaOH溶液將pH調(diào)整為中性；對(duì)黃原膠進(jìn)行沉淀后，將沉淀撈出，加入500 mL乙醇進(jìn)行洗滌；洗滌完成后，得到纖維狀黃原膠，將黃原膠烘干、粉碎、過80目篩。

1) 單因素實(shí)驗(yàn)

按照表1的水平對(duì)提取發(fā)酵液進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)獲得產(chǎn)品按照1.3.1進(jìn)行丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平表Table 1 Single factor test level table

2) 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)提取過程進(jìn)行各因素進(jìn)行正交優(yōu)化，設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，如表2所示。

表2 三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)表Table 2 Three-factor and three-level orthogonal test table

1.3.5 最終產(chǎn)品的驗(yàn)證

將獲得的最終產(chǎn)品加入到酸性乳飲料的配方中。在做實(shí)際測(cè)試時(shí)，可以將黃原膠單獨(dú)去除以測(cè)定CMC對(duì)酸性乳飲料穩(wěn)定性的影響。酸性乳飲料樣品制備好后，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)穩(wěn)定1 d后，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行離心沉淀測(cè)試。

離心沉淀測(cè)試：在產(chǎn)品貯藏1 d后，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行離心沉淀測(cè)試。稱取40 g樣品到離心管中，常溫下以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)10 min，倒出上層液體，再將離心管倒置5 min后稱重。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行測(cè)定，離心沉淀率取平行測(cè)定的平均值。

離心沉淀率的計(jì)算公式為

式中：m1為樣品質(zhì)量；m2為離心后沉淀的質(zhì)量。

離心沉淀率越大時(shí)，產(chǎn)品越不穩(wěn)定。一般認(rèn)為產(chǎn)品離心沉降率在1%以內(nèi)比較穩(wěn)定，大于1%則不夠穩(wěn)定，該值越大產(chǎn)品越不穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃原膠特殊基團(tuán)(丙酮酸和乙酰基)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

在酸性乳飲料調(diào)酸過程中，當(dāng)酪蛋白帶負(fù)電荷較少時(shí)，酪蛋白就會(huì)和黃原膠發(fā)生絡(luò)合作用，絡(luò)合的強(qiáng)度受黃原膠的電荷密度及分子構(gòu)象影響[3]。因此，不同來源黃原膠在產(chǎn)品中具有不同的電荷密度和分子構(gòu)象，和酪蛋白絡(luò)合的強(qiáng)度不同，從而使酸性乳飲料產(chǎn)品具有不同的穩(wěn)定性。丙酮酸基團(tuán)和乙?；屈S原膠分子中的特殊基團(tuán)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著影響黃原膠的溶液特性。其中，丙酮酸基團(tuán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)決定了黃原膠的電荷密度，且黃原膠中丙酮酸基團(tuán)和乙?；|(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃原膠溶液的構(gòu)象轉(zhuǎn)變溫度有一定的影響。實(shí)驗(yàn)中6種不同來源黃原膠的丙酮酸和乙?；|(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)試結(jié)果如表3所示。

表3 6種不同來源黃原膠丙酮酸和乙?；|(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表3可知：專用型黃原膠(US-01和FR-01)的丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3.2%左右，而普通型黃原膠的丙酮酸均在4.9%以上。專用型黃原膠丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)相較普通黃原膠低35%以上，兩者的乙酰基質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差不大，僅CN樣品的乙酰基質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于其他產(chǎn)品，可能是發(fā)酵條件和菌種不同造成的。因此可以認(rèn)為丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)是黃原膠影響酸性乳飲料穩(wěn)定性的因素之一。

2.2 金屬離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

在黃原膠的生物合成中，碳源和無機(jī)鹽是影響黃原膠分子量最顯著的因素[6]。主要通過在培養(yǎng)基中通過添加無機(jī)鹽的方式來引入Ca2+，Mg2+，K+和Na+等離子，這些離子的引入會(huì)對(duì)產(chǎn)品的生物合成速率和終產(chǎn)品的性能(分子量、黏度和耐熱性等)有較大的影響。其中，Ca2+可以作為聚合酶的促進(jìn)因子，提高聚合酶的活性，從而提高黃原膠分子的聚合度和分子量[7-8]；Mg2+是多種激酶和合成酶的激活劑；K+和Na+則是黃單胞菌細(xì)胞膜上鈉鉀泵的組成成分，該泵對(duì)膜上離子的通透性有顯著的影響，它有助于細(xì)胞中大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，既有助于將黃原膠生物合成的能量和前體物質(zhì)葡萄糖轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，也有助于將黃原膠的生物合成的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)出胞外，從而對(duì)黃原膠的生物合成產(chǎn)生顯著影響。6種不同來源黃原膠中Ca2+，Mg2+，K+和Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)試結(jié)果如表4所示。

表4 6種不同來源黃原膠中Ca2+，Mg2+，K+和Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

由表4可知：不同來源黃原膠中金屬離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間最大的差異是專用型黃原膠(US-01和FR-01)含有比較低的Ca2+和較高的Na+，其中Ca2+平均比其他產(chǎn)品低96.36%，Na+平均比其他產(chǎn)品高8.15倍，其它離子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)很小。由此推測(cè)Ca2+殘留可能會(huì)導(dǎo)致酸性乳飲料產(chǎn)品中酪蛋白的沉淀。因而不同來源黃原膠樣品中Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異也許會(huì)導(dǎo)致酸性乳飲料產(chǎn)品具有不同的穩(wěn)定性。而Na+和Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)成反比趨勢(shì)，可能是采用含鈉物質(zhì)代替含鈣物質(zhì)作為解決發(fā)酵過程控制pH的方案造成的。

因此，筆者認(rèn)為專用型黃原膠和普通型黃原膠的主要差異為專用型的Ca2+和丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與普通型的黃原有所區(qū)別。根據(jù)這些區(qū)別，可以在發(fā)酵提取過程中對(duì)Ca2+的添加量和丙酮酸脫除條件進(jìn)行優(yōu)化處理。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在實(shí)際生產(chǎn)過程中，Ca2+的來源主要是在發(fā)酵過程中CaCO3的添加。在黃原膠發(fā)酵過程中，CaCO3不僅可以作為緩沖劑調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中產(chǎn)品pH，防止pH下降過快，從而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此生產(chǎn)過程中，可以在保證產(chǎn)量的前提下，通過發(fā)酵過程中減少CaCO3的添加量，達(dá)到減少Ca2+的目的。

其他因素不變，僅優(yōu)化CaCO3的添加量(以發(fā)酵液質(zhì)量計(jì))，以產(chǎn)膠率、發(fā)酵液黏度、Ca2+含量為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1～3所示。

圖1 不同CaCO3添加量與產(chǎn)膠率的關(guān)系Fig.1 Relationship between the amount of CaCO3 added and the amount of xanthan gum produced

圖2 不同CaCO3添加量與發(fā)酵液黏度的關(guān)系Fig.2 The relationship between different CaCO3addition and fermentation broth viscosity

圖3 不同CaCO3添加量與終產(chǎn)品中鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系Fig.3 Relationship between the amount of different CaCO3 added and the calciumion weight content of the final product

由圖1～3可知：隨著CaCO3添加量的增加，產(chǎn)膠率、發(fā)酵液黏度和Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所提高，其中產(chǎn)膠率先增長(zhǎng)，在CaCO3添加量為0.2‰時(shí)達(dá)到最大后平衡；而發(fā)酵液黏度在CaCO3添加量為0.2‰時(shí)達(dá)到最大增幅，然后緩慢爬升，可能的原因是隨著Ca2+的添加，黃原膠分子之間締合，使發(fā)酵液黏度增大。從Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)來看，在0.2‰添加量時(shí)，Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%，符合前面提到的酸性乳飲料專用型黃原膠的0.09%左右的鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的要求。

2.4 提取過程優(yōu)化

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

pH單因素實(shí)驗(yàn)：如圖4所示，隨著pH的下降，丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先下降后平穩(wěn)的趨勢(shì)，在pH 4.0時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，此時(shí)黃原膠中丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.92%。

圖4 提取液pH對(duì)黃原膠中丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effect of extract pH on pyruvic acid weight content in xanthan gum

溫度單因素實(shí)驗(yàn)：如圖5所示，隨著溫度的升高，丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先下降后平穩(wěn)的趨勢(shì)，但下降幅度沒有pH影響大。在60 ℃時(shí)達(dá)到最小值，此時(shí)黃原膠的丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.62%。

圖5 提取液保溫溫度對(duì)黃原膠中丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effect of incubation temperature of extract on pyruvic acid weight content in xanthan gum

時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)：如圖6所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先下降后平穩(wěn)的趨勢(shì)，但下降幅度沒有pH和溫度影響大。在4 h時(shí)達(dá)到最小值，此時(shí)黃原膠的丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.49%。

圖6 提取液保溫時(shí)間對(duì)黃原膠中丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.6 Effect of incubation time of extract on pyruvateweight content in xanthan gum

通過以上單因素實(shí)驗(yàn)可以看出：pH，溫度和時(shí)間三者與丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降均存在關(guān)聯(lián)，但下降的程度不一，并且均沒有達(dá)到檢測(cè)要求的3.2%，因此對(duì)三者進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

以丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，對(duì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，如表5所示。由表5可知：R(pH)>R(溫度)>R(時(shí)間)，因此在變化的水平范圍內(nèi)，pH對(duì)結(jié)果的影響最大，其次是溫度，而時(shí)間的影響最小。對(duì)于實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，丙酮酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越小越好，因此由K值可知：K3(pH)

表5 以丙酮酸含量指標(biāo)因素水平數(shù)據(jù)處理表

根據(jù)最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)，結(jié)果基本一致。重復(fù)優(yōu)化后，最終丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.12%，符合檢測(cè)結(jié)果3.2%左右的要求。

2.5 終產(chǎn)品驗(yàn)證結(jié)果

通過離心沉淀率指標(biāo)，可以看出酸性乳飲料中蛋白質(zhì)的沉降情況。優(yōu)化后的黃原膠樣品加入酸性乳飲料的離心沉降率如表6所示。

表6 優(yōu)化后黃原膠加入酸性乳飲料中離心沉淀率

由表6可知：優(yōu)化后的產(chǎn)品離心沉淀率和僅加入CMC的樣品相比明顯降低，產(chǎn)品穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)，同時(shí)優(yōu)化后的產(chǎn)品離心沉淀率明顯比專用型的樣品要低。

3 結(jié) 論

酸性乳飲料是近年來發(fā)展比較迅速的飲料產(chǎn)品，但其含有的酪蛋白在酸性條件下極易絮凝沉淀，因此需要添加穩(wěn)定劑。而黃原膠能給其帶來良好的口感，由于黃原膠無法單獨(dú)穩(wěn)定體系，需要和CMC進(jìn)行復(fù)配使用，不同的黃原膠產(chǎn)品復(fù)配后體系穩(wěn)定性不同。通過對(duì)不同黃原膠的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，找到了酸性乳飲料專用型黃原膠和普通型黃原膠的主要差異為專用型Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)和丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)都低于普通型的黃原膠。通過發(fā)酵體系的單因素優(yōu)化，尋找到了最佳的CaCO3添加量為0.2‰。通過在提取過程采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，在pH 3.5，溫度70 ℃，時(shí)間4 h獲得黃原膠丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.12%。最終加入改性黃原膠的酸性乳飲料，穩(wěn)定性較好，使風(fēng)味和穩(wěn)定性均得到了保障。