吳茂蘭 曹慧 焦婷

[摘要] 目的 探討紅景天對間歇低氧（IH）致大鼠肺損傷的干預作用。 方法 建立IH大鼠模型。將45只4周齡雄性SD大鼠按體重隨機分為五組（每組9只）：常氧對照組（A組）、IH組（B組）、IH+低劑量紅景天組（C組）、IH+中劑量紅景天組（D組）、IH+高劑量紅景天組（E組）。實驗45 d后，檢測肺組織勻漿中一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、促紅細胞生成素（EPO）含量及P物質-1（SP-1）和低氧誘導因子-1α（HIF-1α）的mRNA表達水平，分析驗證其相關性，顯微鏡下觀察肺組織病理變化。 結果 與A組比較，B組NO和SOD含量降低，MDA含量升高（均P < 0.01）;與B組比較，C組SOD含量升高（P < 0.01），D組、E組NO、SOD含量升高，MDA含量降低（P < 0.05或P < 0.01）。與A組比較，B組EPO含量及HIF-1α mRNA表達水平升高（均P < 0.01）;與B組比較，C組、D組、E組EPO含量及HIF-1α mRNA表達水平降低（均P < 0.01）。與A組比較，B組TNF-α含量及SP-1 mRNA表達水平升高（均P < 0.01）;與B組比較，C組TNF-α含量降低（P < 0.01），D組、E組TNF-α含量及SP-1 mRNA表達水平降低（均P < 0.01）。相關性分析顯示：TNF-α含量、SP-1 mRNA水平與NO含量（r = -0.55、-0.57）、SOD（r = -0.84、-0.69）呈負相關，與MDA含量（r = 0.55、0.56）、EPO含量（r = 0.69、0.57）、HIF-1α mRNA水平（r = 0.86、0.75）呈正相關（均P < 0.01）。HE結果顯示：IH組肺組織見炎性及缺氧性改變，紅景天干預后改善。 結論 紅景天對IH所致肺損傷有保護作用，可能是通過抗氧化應激、減輕低氧損害、抑制炎性反應途徑實現(xiàn)的。

[關鍵詞] 間歇低氧;紅景天;氧化應激;炎性反應;肺損傷

[中圖分類號] R-332 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）12（c）-0008-06

Effect of Rhodiolae Herba on pulmonary injury induced by intermittent hypoxia in rats

WU Maolan1 ? CAO Hui1 ? JIAO Ting1 ? LIU Weiying2

1.The First Clinical Medical College， Lanzhou University， Gansu Province， Lanzhou ? 730000， China; 2.Department of Respiratory Medicine， the First Hospital of Lanzhou University， Gansu Province， Lanzhou ? 730000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of Rhodiolae Herba on pulmonary injury induced by intermittent hypoxia （IH） in rats. Methods Rat model of IH was established. 45 male and Sprague-Dawley rats aged 4 weeks were randomly divided into 5 group according to weight （9 rats in each group）： normoxia control group （group A）， IH group （group B）， IH with low-dose Rhodiolae Herba group （group C）， IH with medium-dose Rhodiolae Herba group （group D）， IH with high-dose Rhodiolae Herba group （group E）. After 45 days， the contents of nitric oxide （NO）， superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， erythropoietin （EPO）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and the expression levels of hypoxia inducible factors-1α （HIF-1α） mRNA and substance P-1 （SP-1） mRNA in the lung homogenate of rats were detected. The pathological changes under microscope were observed， and the relationship between the indicators， oxidative stress and hypoxic reactions were analyzed. Results Compared with group A， the contents of NO and SOD in group B decreased and the content of MDA increased （P < 0.01）; compared with group B， the content of SOD in group C increased （P < 0.01）， the contents of NO and SOD in group D and group E increased， and the content of MDA decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with group A， EPO content and HIF-1α mRNA expression level in group B increased （all P < 0.01）; compared with group B， EPO content and HIF-1α mRNA expression level in group C， group D and group E decreased （all P < 0.01）. Compared with group A， TNF-α content and SP-1 mRNA expression level in group B increased （P < 0.01）; compared with group B， the TNF-α content in group C decreased （P < 0.01）， TNF-α content and SP-1 mRNA expression level in group D and group E decreased （P < 0.01）. Correlation analysis showed that TNF-α content and SP-1 mRNA level were negatively correlated with NO content （r = -0.55， -0.57）， SOD content （r = -0.84， -0.69）. TNF-α content， SP-1 mRNA level were positively correlated with MDA content （r = 0.55， 0.56）， EPO content （r = 0.69， 0.57）， HIF-1α mRNA level （r = 0.86， 0.75） （all P < 0.01）. HE results showed that the lung tissue of IH group showed inflammatory and anoxic changes， and the prognosis was improved after intervention. Conclusion Rhodiolae Herba has protective effect on lung injury induced by IH， which may be achieved by antioxidant stress， reducing hypoxia damage and inhibiting inflammatory response.

[Key words] Intermittent hypoxia; Rhodiolae Herba; Oxidative stress; Inflammatory response; Lung injury

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）是一種常見的睡眠呼吸疾病，易引起心血管、呼吸及內分泌等多系統(tǒng)損傷[1-3]。間歇低氧（IH）是OSAHS主要的致病因素，該缺氧/復氧循環(huán)類似缺血/再灌注損傷，可啟動氧化應激，致使過氧化物增多、炎性因子水平上調，最終導致細胞損傷、組織結構改變及功能障礙，成為多器官損傷的病理生理基礎[4-5]。但IH對肺損傷的影響鮮有報道，遂行進一步研究。紅景天是景天科、紅景天屬、多年生草本植物，性微甘、澀、寒，具有抗氧化、改善循環(huán)、免疫調節(jié)等多種藥理作用[6]。紅景天對IH所致肺損傷有無影響及作用機制鮮見報道。本研究擬通過建立IH大鼠模型，觀察IH對肺組織氧化應激、低氧損傷、炎性因子及組織結構的影響，并通過紅景天的干預，進一步探討其對IH暴露后肺組織的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡雄性SD大鼠45只[蘭州大學實驗動物中心，合格證號：NO.62000800000260，生產許可證號：SCXK（甘）2018/0002]，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。本實驗遵循實驗動物保護和使用指南，并獲得蘭州大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥品、試劑與儀器

大株紅景天注射液（吉林通化玉圣藥業(yè)有限公司，批號：1001190302）。一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、促紅細胞生成素（EPO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、P物質-1（SP-1）及低氧誘導因子-1α（HIF-1α）試劑盒（北京華英生物技術研究所，生產批號：20180803、201800809、20180812、201809816、20180804、20180810、20180803）;醫(yī)用氧/氮氣（蘭州光華物資公司）;間歇低氧控制系統(tǒng)[7]（蘭州大學第一醫(yī)院呼吸科）;酶標分析儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司，DR-200BS）;半自動生化儀（北京松上技術有限公司，A6）;熒光定量PCR儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司，SLAN-96P）。

1.3 分組與處理

將45只SD大鼠常氧常壓條件飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為五組（每組9只）：常氧對照組（A組）、IH組（B組）、IH+低劑量紅景天組（C組）、IH+中劑量紅景天組（D組）、IH+高劑量紅景天組（E組）。用IH控制系統(tǒng)控制低氧/復氧的頻率及循環(huán)時間。120 s/循環(huán)：30 s氮氣→間歇10 s→20 s氧氣→60 s壓縮空氣。大鼠每日8：00～16：00進艙，艙內氧濃度（低氧期6%～7%，復氧后20%～21%）;A組持續(xù)充壓縮空氣，氧濃度維持20%～21%。其余時間常氧常壓條件飼養(yǎng)。第16天開始，C組、D組及E組腹腔注射大株紅景天（0.05 mL/100 g、0.1 mL/100 g、0.2 mL/100 g，均用0.9%氯化鈉配制成1.0 mL），A組和B組注射0.9%氯化鈉，1.0 mL/只，持續(xù)30 d。后以10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉，在冰床上快速解剖分離大鼠左肺并分成2份，一份液氮凍存，一份多聚甲醛固定。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 比色法（SOD、NO、MDA） ?按試劑盒步驟進行。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附測定法（EPO、TNF-α） ?均質儀勻漿，超聲波碎5 min，3500 g，離心15 min后取上清液，按說明書進行。

1.4.3 RT-PCR（HIF-1α mRNA、SP-1 mRNA） ?反應體系：2×qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol/L基因引物 2.0 μL，反轉錄產物2.5 μL，ddH2O 8.0 μL。HIF-1α：上游引物5′-GCGGCGAGAACGAGAAGAAA-3′、下游引物5′-GGGGAAGTGGCAACTGATGA-3′，擴增片段132 bp。SP-1：上游引物5′-ACAACTTTCACAGGGTGCCA-3′、下游引物5′-AGAGACTGTGCGGTTCTTGG-3′，擴增片段136 bp。擴增條件：預變性95℃，10 min;循環(huán)（40次）95℃，15 s→60℃，60 s;溶解曲線75℃→95℃，每20秒升溫1℃。

1.4.4 HE染色 ?4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，脫蠟，HE染色。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法，相關性采用Pearson相關分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織勻漿中NO、SOD及MDA含量比較

與A組比較，B組NO和SOD含量降低，MDA含量升高（均P < 0.01）;與B組比較，C組SOD含量升高（P < 0.01），D組、E組NO、SOD含量升高，MDA含量降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠肺組織勻漿中EPO含量及HIF-1α mRNA表達水平比較

與A組比較，B組EPO含量及HIF-1α mRNA表達水平升高（均P < 0.01）;與B組比較，C組、D組、E組EPO含量及HIF-1α mRNA表達水平降低（均P < 0.01）。見表2。

2.3 各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α含量及SP-1 mRNA表達水平比較

與A組比較，B組TNF-α含量及SP-1 mRNA表達水平升高（均P < 0.01）;與B組比較，C組TNF-α含量降低（P < 0.01），D組、E組TNF-α含量及SP-1 mRNA表達水平均降低（均P < 0.01）。見表3。

2.4 相關性分析

SP-1 mRNA表達水平、TNF-α含量與NO、SOD含量呈負相關，與MDA、EPO含量及HIF-1α mRNA表達水平呈正相關。見圖1～2。

2.5 各組大鼠肺組織病理顯微鏡檢查結果

A組肺組織形態(tài)結構未見明顯異常。B組可見大量炎癥細胞滲出，動脈管壁顯著增厚及玻璃樣變，纖維組織增生，肺泡腔見多量泡沫樣細胞及灶性出血。C組、D組、E組上述病理變化有改善，以E組最為顯著。見圖3。

3 討論

OSASH被公認為是一種累及多臟器的疾病，其主要病因之一為IH。本研究發(fā)現(xiàn)，IH暴露后大鼠肺組織可見大量炎癥細胞滲出并圍繞血管，小動脈及細動脈管壁顯著增厚及玻璃樣變，肺間質彌漫性纖維組織增生，間隔增寬，部分肺泡腔見多量泡沫樣細胞，并見灶性出血。本研究提示，IH的主要致病機制為低氧應答及氧化應激。HIF-1是缺氧代謝反應的總開關[8]，其生物活性主要由α亞基決定。機體缺氧后為適應低氧環(huán)境促使HIF-1α表達，其通過調控EPO、內皮素-1、血管內皮生長因子等多種靶基因發(fā)揮代償作用。本研究觀察到，IH暴露后，肺組織HIF-1α mRNA表達水平及EPO含量明顯升高，提示IH可致肺組織中HIF-1α持續(xù)累積，刺激EPO生成，從而導致紅細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞生成過多，損傷肺泡Ⅱ型上皮細胞，抑制肺泡表面活性物質的合成和分泌[9]，使血液黏稠、肺順應性降低及氧合障礙，誘發(fā)動脈粥樣硬化、肺纖維化等心肺疾病[10-11]。

IH的另一致病機制為低氧/復氧循環(huán)引起的氧化應激。研究表明，氧化應激可致內皮細胞損傷及修復能力降低[12]、肺血管重塑[13]，從而導致肺動脈高壓、心力衰竭、肺氣腫等[14-15]。本研究顯示，IH暴露后大鼠肺組織SOD、NO含量顯著降低，MDA含量顯著升高，提示IH暴露后肺組織呈高氧化應激狀態(tài)。

此外，有研究表明，IH亦可通過激活NF-κB、TNF-α、白細胞介素-6等介導炎性反應[16]，而這種機制依賴于NADPH氧化酶1（Nox1）對內源性ROS的催化作用。SP-1是Nox1活化的重要轉錄因子，可刺激肥大細胞分泌TNF-α[17]，造成肺血管通透性增加、間質水腫及肺順應性下降，又可通過HIF-1α加重血管內皮損傷[18]。本研究可見，IH暴露后肺組織TNF-α含量及SP-1 mRNA表達水平顯著升高。本研究相關性分析顯示，IH暴露后，肺組織TNF-α含量及SP-1 mRAN表達水平與NO、SOD、MDA、EPO含量和HIF-1α mRNA表達水平之間的變化趨勢存在顯著相關性，表明IH可能通過氧化應激、低氧應答介導炎性反應造成肺損傷，三者相互作用，形成惡性循環(huán)。

大株紅景天注射液是由大株紅景天經微波協(xié)助提取分離、精制、膜過濾而制成的中藥注射液。研究表明，紅景天可通過抑制活性氧簇-NO途徑、降低細胞色素C釋放、提高氧分壓和線粒體活性、改善血黏度、降低血管通透性、抗動脈粥樣硬化[19-20]等多種機制實現(xiàn)抗氧化保護作用。本研究觀察到，經紅景天干預的IH暴露后的大鼠肺組織，其炎性因子TNF-α含量及SP-1 mRNA表達隨氧化應激水平及低氧反應指標的改善而改善，肺組織病理亦明顯改善，并呈顯著的劑量依賴性，提示紅景天可能通過增強抗氧化物質活性、清除過多氧自由基、減少脂質過氧化產物、減輕低氧損害及下調多種炎性因子水平實現(xiàn)對IH所致大鼠肺損傷的保護作用，但具體機制還有待進一步深入研究。

[參考文獻]

[1] ?Lévy P，Kohler M，Mcnicholas WT，et al. Obstructive sleep apnoea syndrome [J]. Nat Rev Dis Primers，2015，1（11）：15015.

[2] ?Jordan AS，Mcsharry DG，Malhotra A. Adult obstructive sleep apnoea [J]. Lancet，2014，383（9918）：736-747.

[3] ?Li J，Lu C，Wang W，et al. Assessment of right atrium dysfunction in patients with obstructive sleep apnea syndrome using velocity vector imaging [J]. Cardiovasc Ultrasoun，2018，16（1）：32.

[4] ?Lurie A. Inflammation，oxidative stress，and procoagulant and thrombotic activity in adults with obstrucive sleep apnea [J]. Adv Cardiol，2011，46：43-66.

[5] ?Marco C，Pietro S，Annapaola Z，et al. Correlation between inflammatory markers of atherosclerosis and carotid intima-media thickness in obstructive，sleep apnea [J]. Molecules，2014，19（2）：1651-1662.

[6] ?劉明成，張得鈞.紅景天藥理作用研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9（6）：65-69.

[7] ?劉維英，余勤，岳紅梅.一種實驗動物氧艙結構：CN205 511448U [P]. 2016.

[8] ?Choudhry H，Harris AL. Advances in hypoxia-inducible factor biology [J]. Cell Metab，2018，27（2）：281-298.

[9] ?Suresh MV，Ramakrishnan SK，Thomas B，et al. Activation of hypoxia-inducible factor-1α in type 2 alveolar epithelial cell is a major driver of acute inflammation following lung contusion [J]. Crit Care Med，2014，42（10）：e642-e653.

[10] ?向永紅，蘇曉麗，賀若曦，等.不同低氧方式對大鼠血清和組織局部腎素血管緊張素系統(tǒng)的影響[J].中華結核和呼吸雜志，2012，35（1）：33-36.

[11] ?Chen LN，Yang XH，Nissen DH，et al. Dysregulated renin-angiotensin system contributes to acute lung injury caused by hind-limb ischemia-reperfusion in mice [J]. Shock，2013，40（5）：420-429.

[12] ?Tuleta I，F(xiàn)ran？觭a CN，Wenzel D，et al. Hypoxia-induced endothelial dysfunction in apolipoprotein E-deficient mice，effects of infliximab and L-glutathione [J]. Atherosclerosis，2014，236（2）：400-410.

[13] ?Ma L，Zhang J，Liu Y. Roles and mechanisms of obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome and chronic intermittent hypoxia in atherosclerosis：evidence and prospective [J]. Oxid Med Cell Longev，2016，2016：8215082.

[14] ?Lu W，Kang J，Hu K，et al. Angiotensin-（1-7） relieved renal injury induced by chronic intermittent hypoxia in rats by reducing inflammation，oxidative stress and fibrosis [J]. Braz J Med Bio Res，2017，50（1）：e5594.

[15] ?Dumitrascu R，Heitmann J，Seeger W，et al. Obstructive sleep apnea，oxidative stress and cardiovascular disease：lessons from animal studies [J]. Oxid Med Cell Longev，2013， 2013：234631.

[16] ?Lee Y，Wang Y，Mak J，et al. Intermittent hypoxia induces NF-κB-dependent endothelial activation via adipocyte-derived mediators [J]. Am J Physiol Cell Physiol，2016，310（6）：C446-C455.

[17] ?Guo S，Wang H，Luo Y，et al. Sp-1 negatively regulates miR-20b expression in macrophages [J]. Ann Clin Lab Sci，2017，47（6）：706-712.

[18] ?Songbai Y，Jian Y，Xuhui H. Inhibition of miR-135b by SP-1 promotes hypoxia-induced vascular endothelial cell injury via HIF-1α [J]. Exp Cell Res，2018，370（1）：31-38.

[19] ?Li Y，Wu J，Shi R，et al. Antioxidative effects of rhodiola genus：phytochemistry and pharmacological mechanisms against the diseases [J]. Curr Top Med Chem，2017，17（15）：1692-1708.

[20] ?Ni J，Li YM，Li WM，et al. Salidroside protects against foam cell formation and apoptosis，possibly via the MAPK and AKT signaling pathways [J]. Lipids Health Dis，2017， 16（1）：198.

（收稿日期：2019-08-21 ?本文編輯：李亞聰）