劉晟男 錢甜甜 郎慧玲

[摘要] 目的 探討抑制JNK通路對染料木黃酮（Genistein）誘導(dǎo)肝癌MHCC97-L細(xì)胞凋亡及caspase-3和caspase-9活性的影響。 方法 實驗分為對照組、SP600125（SP）10、20、30 μmol/L組。蛋白質(zhì)印跡法篩選SP的最適工作濃度。實驗分對照組、Gen組、SP組和聯(lián)用組，倒置顯微鏡、熒光顯微鏡和分光光度法分別檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)、細(xì)胞凋亡指數(shù)、caspase-3和caspase-9活化水平。 結(jié)果 SP能明顯阻斷P-JNK蛋白表達(dá)（P < 0.01），其最小工作濃度為20 μmol/L。倒置顯微鏡下，各藥物組細(xì)胞均出現(xiàn)染色質(zhì)著色變深或局部凝集的凋亡特征性改變，以聯(lián)用組細(xì)胞變化最為明顯。熒光顯微鏡下，各藥物組均可觀察到早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞。與對照組比較，所有藥物組凋亡指數(shù)均明顯升高（P < 0.01），且聯(lián)用組高于Gen組和SP組（P < 0.01）。與對照組比較，所有藥物組的caspase-3和caspase-9活性均明顯升高（P < 0.01）。與Gen組、SP組比較，聯(lián)用組caspase-3活性最高（P < 0.01），SP組caspase-3活性高于Gen組（P < 0.01）;聯(lián)用組caspase-9活性高于Gen組（P < 0.01），SP組與Gen組、聯(lián)用組與SP組caspase-9活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 抑制JNK通路可通過激活caspase依賴的線粒體途徑來促進(jìn)Genistein誘導(dǎo)MHCC97-L細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 染料木黃酮;JNK通路;肝癌MHCC97-L細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R735.7 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）12（c）-0019-05

Effect of Genistein inducing liver cancer MHCC97-L cells apoptosis and activity of caspase-3 and caspase-9 through inhibiting JNK pathway

LIU Shengnan1 ? QIAN Tiantian1 ? LANG Huiling1 ? YU Jiaqi1 ? XIONG Mengqi1 ? ZHAO Zhongxin2 ? MEI Qingbu1 ? LIU Dan1

1.Basic Medical College， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar ? 161006， China; 2.Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar ? 161041， China

[Abstract] Objective To explore the effect of Genistein inducing liver cancer MHCC97-L cells apoptosis and activity of caspase-3 and caspase-9 through inhibiting JNK pathway. Methods The experiment was divided into control group and SP600125 （SP） 10， 20， 30 μmol/L groups. Western blotting was carried out to search the optimum working concentration of SP. The experiment was divided into control， Gen， SP and combined groups. Apoptosis morphology， apoptosis index， activity of caspase-3 and caspase-9 were detected by inverted microscope， fluorescence microscope and spectrophotometry respectively. Results SP obviously blocked the expression of P-JNK protein at a minimum working concentration of 20 μmol/L （P < 0.01）. Under inverted microscope， chromatin became darker or condensate in each drug group， and cell changes most obvious in combined group. Early apoptotic cells and late apoptotic cells were observed under fluorescence microscope. Compared with control group， apoptotic index of all drug groups was significantly increased （P < 0.01）， among which apoptotic index of combined group was highest and pro-apoptotic effect was stronger than that of Gen group and SP group （P < 0.01）. Compared with control group， the activity of caspase-3 and caspase-9 in all drug groups were significantly increased （P < 0.01）. Compared with Gen group and SP group， the activity of caspase-3 in combination group was the highest （P < 0.01）， and the activity of caspase-3 in SP group was higher than that in Gen group （P < 0.01）. The activity of caspase-9 in the combination group was higher than that in the Gen group （P < 0.01）， while the activity of caspase-9 in the SP group and Gen group and the combined group and the SP group have no significant differences （P > 0.05）. Conclusions These results suggest that inhibition of JNK pathway can promote the apoptosis of Gen induced MHCC97-L cells by activating the caspase-dependent mitochondrial pathway.

[Key words] Genistein; JNK pathway; Liver cancer MHCC97-L cells; Apoptosis

目前肝癌是全球癌癥死亡的第四大原因[1]，是中國癌癥死亡的第二大原因[2]，盡管在預(yù)防、篩查、診斷和治療肝癌方面的技術(shù)都取得了新進(jìn)展，但肝癌的發(fā)病率和死亡率仍持續(xù)上升。值得關(guān)注的是女性患肝癌的風(fēng)險低于男性[3-4]，這種差異與雌激素水平有關(guān)[5-6]。染料木黃酮（Genistein，簡稱Gen）是一種具有雌激素活性的天然物質(zhì)，最新的研究表明[7]，膳食攝取Gen可通過caspase途徑增加肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展。逃避凋亡是癌癥的特征之一[8]，c-Jun氨基末端激酶（JNK）是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要信號通路，在肝癌細(xì)胞系、肝癌組織樣本和肝癌異種移植瘤中，JNK1的活性升高[9]，且與患者預(yù)后較差有關(guān)[10]。SP600125（SP）是一種強(qiáng)效的JNK通路抑制劑，可以抑制JNK磷酸化。盡管Gen是一種已知的肝癌抑制因子，但其作用機(jī)制尚未闡明?；贘NK與凋亡的密切聯(lián)系，本研究以人肝癌MHCC97-L細(xì)胞為研究對象，在課題組的前期研究基礎(chǔ)之上[11-13]，探討抑制JNK通路對caspase依賴的線粒體凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人肝癌MHCC97-L細(xì)胞購自復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所。Gen（批號：G6649-25mg）購自Sigma公司;SP（批號：A2714）購自Santa Cruz公司;DMEM高糖培養(yǎng)液（批號：AC11223264）購自Hyclone公司;胎牛血清（批號：20170713）購自杭州四季青公司;caspase-3（批號：2018-02-10）、caspase-9（批號：2018-03-03）蛋白活化檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒（批號：20170327）購自南京凱基生物公司;T-JNK多克隆抗體（批號：B3901）和P-JNK （T183/Y185）多克隆抗體（批號：B6701）購自Immunoway公司;β-actin多克隆抗體（批號：12cm81）購自武漢博士德生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) ?MHCC97-L細(xì)胞用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分兩個系列組，第一系列分為對照組、SP 10、20、30 μmol/L組;第二系列分為對照組、Gen組（80 μmol/L）、SP組（20 μmol/L）和聯(lián)用組（SP 20 μmol/L+Gen 80 μmol/L）。取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 蛋白質(zhì)印記法篩選SP的最適工作濃度 ?細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板，加入第一系列處理因素的培養(yǎng)液2 mL，處理6 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整樣品蛋白濃度為2 μg/μL，樣品蛋白煮沸變性。取各組樣品蛋白30 μg上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至NC膜上，封閉2 h，TBS洗滌3次，一抗P-JNK（1∶1000）、T-JNK（1∶1000）、β-actin（1∶400）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，HRP標(biāo)記二抗室溫2 h，TBS洗滌2次，TBST洗滌1次，ECL發(fā)光，顯影，定影，目的蛋白表達(dá)量用相對灰度值表示。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化 ?細(xì)胞以1×105個/孔接種于12孔板，加入第二系列處理因素的培養(yǎng)液1.5 mL，處理48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡指數(shù) ?細(xì)胞以5×104個/孔接種于24孔板，加入第二系列處理因素的培養(yǎng)液1 mL，處理48 h后，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入Annexin V-FITC和PI的混合液，室溫避光反應(yīng)5 min，于熒光顯微鏡下，用雙色濾光片觀察，Annexin V-FITC呈綠色信號，PI呈紅色信號。在高倍鏡（400×）下隨機(jī)計數(shù)5個視野，計算各組細(xì)胞凋亡指數(shù)，用凋亡細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的比值來表示。

1.2.5 分光光度法檢測caspase-3、caspase-9活化程度 ?細(xì)胞以3×106濃度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，加入第二系列處理因素的培養(yǎng)液5 mL，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整樣品蛋白濃度為2 μg/μL。取50 μL的樣品蛋白，加入caspase-3或caspase-9 Substrate，37℃避光孵育4 h，于酶標(biāo)儀檢測405 nm的吸光度值。用藥物組與對照組的吸光度比值來表示各藥物組caspase-3和caspase-9的活化程度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)印跡法檢測P-JNK蛋白的表達(dá)

與對照組比較，SP 3個組中P-JNK蛋白表達(dá)均顯著降低（P < 0.01）。SP最小工作濃度為20 μmol/L。見圖1。

2.2 倒置顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

所有藥物組細(xì)胞密度降低，細(xì)胞皺縮、變形、透明度下降，細(xì)胞質(zhì)可見較大的“空泡”結(jié)構(gòu)，核仁不清晰，染色質(zhì)著色變深或局部凝集，聯(lián)用組細(xì)胞變化最為明顯。見圖2。

2.3 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)

熒光顯微鏡下，各藥物組均可觀察到早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞。與對照組比較，所有藥物組的凋亡指數(shù)均明顯升高（P < 0.01），聯(lián)用組凋亡指數(shù)高于Gen組、SP組（P < 0.01），但Gen組和SP組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

2.4 分光光度法檢測MHCC97-L細(xì)胞caspase-3及caspase-9的活性

與對照組比較，所有藥物組的caspase-3和caspase-9活性均明顯升高（P < 0.01）;與Gen組、SP組比較，聯(lián)用組caspase-3活性最高（P < 0.01），SP組caspase-3活性高于Gen組（P < 0.01）;聯(lián)用組caspase-9活性高于Gen組（P < 0.01），SP組與Gen組、聯(lián)用組與SP組caspase-9活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4。

3 討論

JNK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs），由3個基因編碼，JNK1和JNK2廣泛表達(dá)于大多數(shù)細(xì)胞和組織，JNK3主要在心臟、大腦和睪丸中表達(dá)。JNK作為一類蛋白激酶，可被多種應(yīng)激因素所激活，激活后可以磷酸化核內(nèi)和胞質(zhì)內(nèi)的許多靶向底物，意味著JNK既可以通過核轉(zhuǎn)錄途徑，也可以直接作用于胞質(zhì)底物，如Bcl-2家族蛋白，來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，而且JNK在細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡之間起關(guān)鍵的調(diào)控作用，這兩種生物學(xué)效應(yīng)之間的平衡，通常是由細(xì)胞環(huán)境所決定的，最終決定細(xì)胞增殖或者凋亡[14-16]。JNK介導(dǎo)的線粒體凋亡是由caspase-9啟動的內(nèi)源性凋亡途徑，調(diào)控抗凋亡蛋白Bcl-2活性和促凋亡蛋白Bax和Bad轉(zhuǎn)位，增加線粒體膜的通透性，導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素C，觸發(fā)caspase-9級聯(lián)反應(yīng)，最終激活caspase-3[17]。

JNK在癌癥發(fā)展中的作用在已報道的研究中，結(jié)果不一，顯示其具有雙面效應(yīng)，肝癌亦是如此。一些研究支持激活JNK具有促進(jìn)肝癌的作用。與癌旁肝組織比較，大約56%的肝癌組織JNK1被激活[9，18]，比較High-JNK1和Low-JNK1肝癌組織的基因表達(dá)譜確定了927個過表達(dá)的與JNK1相關(guān)的標(biāo)記基因[10]。用JNK抑制劑D-JNK1處理肝癌異種移植瘤小鼠，可觀察到腫瘤組織減小了一半，明確了JNK1的活性在小鼠肝癌形成后期是必需的[8]。骨髓細(xì)胞特異性JNK缺乏的小鼠表現(xiàn)出對肝細(xì)胞炎癥和肝癌的抑制作用[19]，提示非肝實質(zhì)細(xì)胞也可能作為JNK功能的位點，因此用抑制JNK的藥物靶向骨髓細(xì)胞可能作為炎癥性肝病的治療方案。當(dāng)肝癌細(xì)胞同時暴露于順鉑和SP時，細(xì)胞生長受到更大的抑制，細(xì)胞凋亡得到促進(jìn)，提示抑制JNK通路可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[20]。本研究結(jié)果顯示，Gen能通過活化caspase-9和caspase-3激活線粒體凋亡通路，且抑制JNK通路可顯著提升Gen的促MHCC97-L細(xì)胞凋亡作用。值得注意的是SP在上調(diào)caspase-3活性的作用中明顯高于Gen（P < 0.01），雖然SP在caspase-9活性和細(xì)胞凋亡率中與Gen差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），但是顯示出略強(qiáng)的作用趨勢。SP與聯(lián)合組caspase-9活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），進(jìn)一步提示Gen可能主要通過JNK通路來調(diào)控caspase-9的活化水平。因此，JNK通路可能成為一個更為強(qiáng)效的抗腫瘤靶點。另一部分研究提供了JNK活化有抑制肝癌的證據(jù)。姜黃素衍生物WZ35可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并能促進(jìn)Ros依賴的JNK活化，但是SP可以顯著逆轉(zhuǎn)WZ35引起的上述作用[21]。高車前素是一種酚類黃酮，對肝癌細(xì)胞具有抗增殖作用，激活caspase-3，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，同樣應(yīng)用SP能顯著抑制高車前素在肝癌細(xì)胞的抗癌作用[22]。以上實驗資料支持了JNK通路在肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和化療反應(yīng)等方面的雙重作用，這可能與細(xì)胞類型、所受的刺激因素、通路靶向信號分子的多樣性、信號分子持續(xù)活化的水平和作用時間有關(guān)，因此JNK通路如何在細(xì)胞生存和細(xì)胞死亡之間做出選擇，尚待深入研究。

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（收稿日期：2019-09-10 ?本文編輯：劉永巧）