張可可，席宇，吳少雄，弓麗珊，陰紅霞，劉人聚， 薛夢娟，張亞然，劉巖*

(1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450001；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 與檢測技術(shù)研究所，鄭州 450002)

食源性致病菌通過食物等途徑進(jìn)入人體后大量繁殖并產(chǎn)生內(nèi)毒素進(jìn)而對人體健康造成損害。比如，蠟樣芽孢桿菌能夠?qū)е率澄锔瘮?，并產(chǎn)生腹瀉型腸毒素[1]、嘔吐型腸毒素[2]、細(xì)胞毒素[3]、溶血素等多種毒素來危害人體健康[4，5]，而大腸桿菌多利用黏附素使細(xì)菌定植于泌尿道和腸道，大量繁殖后產(chǎn)生多種外毒素。近年來，食品安全問題已成為當(dāng)今世界性公共衛(wèi)生熱點(diǎn)[6，7]。因此，食源性疾病的防治已經(jīng)迫在眉睫。

食品加工過程中可通過高溫、高壓、控制pH、紫外線和激光照射等物理方法減少或消除食源性致病菌的危害[8-11]，然而設(shè)備昂貴，流程繁多，滅菌往往不徹底。利用化學(xué)消毒劑和防腐劑等物質(zhì)抑制食源性致病菌的生長和繁殖也有一定的弊端，部分人群易產(chǎn)生抵觸情緒[12，13]。如何選擇合適的消毒防腐劑和控制最佳的用量已成為目前的最大難題，同時食品釀造行業(yè)中消毒劑等殘留也可能留下食品安全隱患，因此，目前利用化學(xué)類消毒劑和防腐劑防治食源性致病菌并不是一種理想的方法。生物法是利用植物提取物或微生物代謝物抑制病原菌[14-20]。在理化手段受限的情況下，利用生物源天然抑菌物質(zhì)來防治食源性致病菌已引起眾多科研者的興趣。芽孢桿菌可以分泌多種類型的天然抗菌活性物質(zhì)，在食品加工行業(yè)具有潛在的用途[21-24]。本研究從煙田土壤中分離、鑒定了一株芽孢桿菌SX09，并初步研究了其對幾株常見的食源性致病菌和食品腐敗霉菌的抑制作用，旨在為天然食品添加劑的選擇提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、供試菌株及培養(yǎng)基

分離拮抗芽孢桿菌的土壤樣品于2017年8月采集于河南省南陽市某煙田。0.5%的堿性復(fù)紅染色液、平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、營養(yǎng)瓊脂(NA)、營養(yǎng)肉湯(NB)及胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)：購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖水(PDW)：購自青島海博生物技術(shù)有限公司。芽孢桿菌分離純化采用NA和NB培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)供試菌株、菌株來源及培養(yǎng)基見表1。

表1 供試菌株、菌株來源及培養(yǎng)基Table 1 Tested strains, strains' source and culture media

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KPS高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；Avanti J-25低溫高速離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；GHP-9160恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定系統(tǒng) 法國生物梅里埃公司；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；Eclipse E200生物顯微鏡 尼康儀器有限公司；Autof ms1000全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng) 鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.3 土壤中拮抗芽孢桿菌菌株的篩選

在含45 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中無菌操作加入5 g土樣，150 r/min振蕩20 min，75 ℃水浴10 min，靜置5 min后取懸液劃線于NA平板，42 ℃培養(yǎng)48 h，將優(yōu)勢的單菌落繼續(xù)劃線純化獲得純培養(yǎng)。以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為目標(biāo)菌株采用牛津杯進(jìn)行拮抗芽孢桿菌的篩選[25]：培養(yǎng)皿中加入10 mL的2%的水瓊脂，凝固后距平板中心1.5 cm處分別放置3個牛津杯，20 mL冷卻至50 ℃的PCA培養(yǎng)基中加入0.5 mL目標(biāo)菌液混合均勻后傾注入培養(yǎng)皿中，凝固后取出牛津杯。分離菌株在NB中培養(yǎng)24 h后過濾獲得無菌發(fā)酵液，3個牛津杯孔分別加入100 μL無菌生理鹽水、100 μL NB和100 μL無菌發(fā)酵液，4 ℃冰箱中放置4 h后，于37 ℃培養(yǎng)16 h，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈。

1.4 篩選芽孢桿菌菌株的鑒定

分離菌株接種到NA平板上于37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，定時觀察培養(yǎng)特征；石碳酸復(fù)紅染液進(jìn)行單染色，鏡檢觀察菌體特征；采用法國梅里埃VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生理生化特征的測定；采用鄭州安圖生物工程股份有限公司的全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(Autof ms1000)進(jìn)行菌株的質(zhì)譜特征測定；篩選菌株的16S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增及測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行，序列同源性的分析參考文獻(xiàn)[24]和文獻(xiàn)[26]進(jìn)行。

1.5 篩選芽孢桿菌菌株抗菌譜的測定

參考1.3的方法檢測篩選菌株在PDW中發(fā)酵24 h的無菌上清液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌和阪崎腸桿菌的抑制效果。篩選菌株對根霉菌、齊整小核菌和青霉菌的抑制效果檢測采用1.3的牛津杯法，略有改動：除培養(yǎng)皿上層傾注20 mL冷卻至55 ℃的PDA外，培養(yǎng)皿下層水瓊脂的傾注、牛津杯的放置及牛津杯孔物質(zhì)的添加均按1.3的方法進(jìn)行。牛津杯孔加樣后于4 ℃冰箱放置4 h，培養(yǎng)皿中心分別接入一個5 mm供試菌菌塊于30 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，觀察抑菌圈是否產(chǎn)生。

2 結(jié)果與討論

2.1 拮抗菌株的篩選

通過高溫抗性選擇和劃線純化處理，從采集的土樣中分離出6株細(xì)菌，經(jīng)染色鏡檢，初步判斷6株菌均為芽孢桿菌。以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和青霉菌為目標(biāo)菌株進(jìn)行拮抗性能篩選，獲得一株同時能夠拮抗供試細(xì)菌和真菌的芽孢桿菌，命名為SX09。SX09的發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均產(chǎn)生明顯的抑菌圈。

2.2 拮抗菌株的菌落及菌體特征

在NA平板上培養(yǎng)36 h后，菌株SX09的菌落形態(tài)見圖1。SX09的菌落干燥，暗白色，圓形邊緣不規(guī)則，表面褶皺，中間有環(huán)狀凸起，菌落直徑為2～3 mm(見圖1a)。染色后鏡檢菌體呈現(xiàn)桿狀，芽孢多為端生(見圖1b)。

圖1 菌株SX09在NA上菌落特征及菌體形態(tài)(×1000倍)Fig.1 Colony characteristics and mycelial morphology of strain SX09 on NA (1000 times)

2.3 拮抗菌株的生理生化反應(yīng)

采用GP鑒定卡對菌株SX09的生理生化反應(yīng)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明菌株SX09可利用苦杏仁苷、D-木糖、環(huán)式糊精、蔗糖、D-山梨醇、D-半乳糖、D-核糖、乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-麥芽糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-棉子糖和D-海藻糖，不能利用水楊素；精氨酸雙水解酶、α-葡萄糖糖苷酶和焦谷氨酸芳胺酶等呈陽性，磷脂酰磷脂酶C、β-半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶和丙氨酸芳胺酶等呈陰性，生理生化反應(yīng)與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)比較接近[27]。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 分離菌株的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of isolated strains

續(xù) 表

注：“+”表示結(jié)果呈陽性；“-”表示結(jié)果呈陰性。

2.4 篩選菌株的質(zhì)譜檢測

采用鄭州安圖生物工程股份有限公司的全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(Autof ms1000)對菌株SX09進(jìn)行鑒定，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索分析，菌株SX09的分值為8.732，介于6.0～9.0范圍內(nèi)，因此MALDI-TOF MS只能初步將菌株SX09鑒定為芽孢桿菌屬。

2.5 篩選菌株16S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

提取菌株SX09的基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增其16S rDNA序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1500 bp附近出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增條帶(見圖2)，回收測序，序列長度為1592 bp。菌株SX09的16S rDNA基因序列在GeneBank進(jìn)行比對，選取同源性較高的14株芽孢桿菌和同源性相對不高的10株芽孢桿菌的16S rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖3)，結(jié)果顯示：菌株SX09和多株枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌處于一個分支，置信度為88，因此，綜合考慮菌株SX09的菌落、形態(tài)和生理生化特性，初步將菌株SX09鑒定為一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(BacillusmethylotrophicusSX09)。

圖2 菌株SX09的16S rDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR amplification result of 16S rDNA sequence of strain SX09

圖3 基于16S rDNA基因序列的菌株SX09的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain SX09 based on 16S rDNA gene sequence

2.6 菌株SX09對供試食源性致病菌的拮抗作用

菌株SX09對供試的5株食源性致病菌均有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑見表3。菌株SX09對供試大腸埃希氏菌的抑制效果最佳，其抑菌圈直徑達(dá)(26.3±0.34) mm，而對金黃色葡萄球菌的抑菌效果相對較差，抑菌圈直徑為(20.5±0.19) mm。阪崎腸桿菌、單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為(25.2±0.56) mm、(22.7±0.15) mm和(23.4±0.20) mm。通過對實(shí)驗(yàn)室保藏的3株食品腐敗霉菌的抑制性能進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株SX09對3株霉菌也具有較強(qiáng)的抑制作用，尤其是根霉菌的抑菌圈直徑可達(dá)(24.7±0.16) mm。

表3 菌株 SX09對幾株供試菌株的抑菌效果Table 3 Antibacterial effect of strain SX09 against several tested strains

3 結(jié)論

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌是一種值得我們開發(fā)和利用的微生物，本實(shí)驗(yàn)初步確定菌株 SX09為一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，對供試的食源性致病菌具有抑制作用，尤其是對阪崎腸桿菌具有較強(qiáng)的抑制效果，抑菌圈直徑可達(dá)(25.2±0.56) mm。此外， 菌株SX09對3株食品腐敗霉菌也具有明顯的抑制效果，推測該菌具有廣譜的抗菌性能。菌株SX09在PDW中發(fā)酵可產(chǎn)生胞外抑菌物質(zhì)，該種抑菌物質(zhì)對常見食源性致病菌和霉菌都有一定的抑菌效果，因此在食品加工領(lǐng)域具有一定潛在的商業(yè)應(yīng)用價值。