范霞,陳榮順

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，南京 210095)

醬油是中國傳統(tǒng)的調(diào)味品，滋味鮮美，有助于促進(jìn)食欲，已經(jīng)成為人們飲食中不可缺少的一種調(diào)味品[1]。由于釀造醬油生產(chǎn)成本高，在利益的驅(qū)使下，以配制醬油冒充釀造醬油的現(xiàn)象較為普遍。釀造醬油的揮發(fā)性成分種類較多，主要包括醇類、醛類、酮類、酚類、酯類和含硫化合物等。配制醬油的風(fēng)味物質(zhì)遠(yuǎn)比釀造醬油少，因而醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味組分在一定程度上能反映其品質(zhì)的高低。

HS-SPME/GC-MS作為一種高效的萃取、分離檢測方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醬油香氣成分分析領(lǐng)域[2-6]。氣味是體現(xiàn)食品質(zhì)量品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[7]，電子鼻能快速識別不同等級、不同品牌的醬油[8-10]。醬油組成成分復(fù)雜，除食鹽、糖類、有機(jī)酸、色素及香料等成分外，還包含多種氨基酸，根據(jù)各氨基酸的含量可以識別不同等級的醬油[11,12]。

本研究首次利用HS-SPME/GC-MS和電子鼻技術(shù)并結(jié)合氨基酸組成分析對醬油中的風(fēng)味物質(zhì)和游離氨基酸進(jìn)行研究，為醬油的品質(zhì)評價(jià)提供了一種快速、有效的檢測方法。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

5種市售高鹽稀態(tài)釀造醬油：1號海天特級草菇老抽；2號海天特級金標(biāo)生抽；3號海天一級草菇老抽；4號海天三級鮮味生抽；5號海天特級味極鮮，均購于南京當(dāng)?shù)爻?。氨基酸?biāo)準(zhǔn)品：濃度為2.5 μmol/mL，日本日立公司；緩沖液B1、B2、B3、B4、B5，茚三酮顯色液：日本日立公司。

1.2 儀器

GC 7890A-5975C MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent公司；65 μm PDMS/DVB手動(dòng)SPME進(jìn)樣器 美國Supelco公司；PEN3便攜式電子鼻 德國Airsense公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；分析天平 美國梅特勒-托利多公司；磁力攪拌器 精鑿科技(上海)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HS-SPME/GC-MS法對醬油香氣成分分析

準(zhǔn)確稱取醬油8.00 g，放入20 mL的頂空瓶中，加入氯化鈉固體1.50 g，在50 ℃下攪拌20 min，使醬油香氣充分揮發(fā)。將250 ℃下預(yù)先老化5 min的固相微萃取頭插入頂空瓶內(nèi)樣品上方，固定好SPME手柄，推出纖維頭吸附60 min后取出，立即插入GC-MS儀器進(jìn)樣口，在250 ℃條件下解吸附5 min。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持5 min，先以4 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至220 ℃，保持6 min；載氣為99.999%的高純氦氣，流量為1.0 mL/min；采用不分流模式進(jìn)樣。

質(zhì)譜檢測條件：電子轟擊(EI)電離源，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃；四級桿溫度150 ℃；輔助加熱溫度250 ℃。

利用NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫并結(jié)合人工解析，選擇匹配度不小于80(最大值是100)的峰對醬油的香氣物質(zhì)進(jìn)行定性分析，各色譜峰的峰面積與總峰面積的比值為各香氣成分的相對含量。

2.2 電子鼻對醬油主成分分析

準(zhǔn)確稱取8.00 g醬油，置于100 mL的燒杯中，用保鮮膜封口，靜置30 min后開始用電子鼻檢測，每個(gè)樣品重復(fù)5次。

電子鼻測定條件：傳感器清洗時(shí)間為100 s；傳感器歸零時(shí)間為10 s；樣品準(zhǔn)備時(shí)間為5 s；分析采樣時(shí)間為120 s，內(nèi)部流量為400 mL/min，進(jìn)樣流量為400 mL/min。

2.3 5種醬油游離氨基酸含量比較

稱取醬油樣品2.00 mL，用1 mL 10%的磺基水楊酸沉淀蛋白，最后用水定容至25.00 mL的容量瓶中。取5 mL搖勻的醬油溶液，在轉(zhuǎn)速為10000 r/min的條件下，離心10 min。然后吸取1 mL，用水稀釋至25.00 mL的容量瓶中，最后吸取1 mL過濾膜進(jìn)樣。每種醬油重復(fù)3次，取平均值。

L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀測定條件：日立鈉離子交接樹脂4.6 mm×60 mm；泵1流速0.4 mL/min，泵2流速0.35 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL；柱溫57 ℃，反應(yīng)溫度135 ℃；檢測波長570 nm和440 nm。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0(IBM)和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用電子鼻設(shè)備自帶Win muster分析軟件對115 s處G/G0值進(jìn)行PCA分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 HS-SPME/GC-MS檢測醬油中的風(fēng)味物質(zhì)

利用HS-SPME/GC-MS技術(shù)檢測醬油中的風(fēng)味物質(zhì)，5種醬油共檢測出63種香氣物質(zhì)，相對百分含量結(jié)果見表1。1號特級草菇老抽的主體香氣成分是2-乙?；量⒖反?、苯乙醛、5-甲基-2-呋喃甲醇，相對含量共計(jì)79.75%。3號一級草菇老抽的主體揮發(fā)性香氣物質(zhì)是2-乙酰基吡咯、糠醇、苯乙醛、2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛，相對含量達(dá)81.11%。2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛是3號醬油特有的風(fēng)味物質(zhì)。2號金標(biāo)生抽、4號鮮味生抽、5號味極鮮的主體香氣物質(zhì)是乙醇和苯乙醇，相對含量分別是86.24%、70.04%、78.97%。Lee等[13]利用SPME結(jié)合GC-MS對發(fā)酵醬油和酸水解醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了對比分析，得知醇類和酯類是發(fā)酵醬油中的主要物質(zhì)，雜環(huán)類和酸類是酸水解醬油中的主要物質(zhì)。趙謀明等[14]通過頂空-固相微萃取(HS-SPME)的方法萃取醬油的風(fēng)味物質(zhì)，并采用氣相色譜-質(zhì)譜/嗅聞技術(shù)(GC-MS和GC-O)聯(lián)用的方法分離鑒定出11種揮發(fā)性香氣化合物，其中醇類相對百分含量達(dá)75.82%。5種醬油共同含有的香氣成分有10種，包括醇類1種，苯乙醇；雜環(huán)化合物5種，糠醇、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯、3-苯基呋喃、氰化芐；酚類1種，愈創(chuàng)木酚；醛類3種，苯乙醛、壬醛、癸醛。

表1 醬油中的香氣成分及相對含量Table 1 Aroma components and relative content in soy sauce

續(xù) 表

續(xù) 表

注：“-”表示未檢測到或不存在。

醬油中的香氣物質(zhì)根據(jù)官能團(tuán)種類主要分為醇類、酚類、醛酮類、酯類、酸類、雜環(huán)化合物、含硫化合物及其他。1號特級草菇老抽、2號金標(biāo)醬油、3號一級草菇醬油、4號鮮味生抽、5號味極鮮分別檢測出31，29，27，32，34種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，結(jié)果見表2。

表2 醬油中所含香氣物質(zhì)分類Table 2 Classification of aroma substances in soy sauce

醇類是醬油在生產(chǎn)過程中由酵母酒精發(fā)酵和氨基酸降解產(chǎn)生的一種常見的香味物質(zhì)。其中乙醇能產(chǎn)生令人愉快的酒香味，苯乙醇是酵母菌乙醇發(fā)酵降解苯丙氨酸的產(chǎn)物，具有花草和水果的香氣[15]。本研究中，醇類物質(zhì)是各醬油中種類數(shù)較少且含量相差較大的一類風(fēng)味物質(zhì)。1，3號醬油醇類化合物相對含量較少；2，4，5號醬油，乙醇和苯乙醇作為主體成分，相對百分含量高達(dá)70.04%～86.24%。酚類物質(zhì)主要是來自小麥的原料經(jīng)米曲霉作用后再經(jīng)酵母發(fā)酵而成的，具有香氣特征明顯、活性強(qiáng)的特征，對醬油風(fēng)味有較大的貢獻(xiàn)。其中，4-乙基愈創(chuàng)木酚是提高醬油香氣的關(guān)鍵，為醬油帶來類似丁香和煙熏的香味[16]。2，4，5號醬油中4-乙基愈創(chuàng)木酚相對含量分別是0.35%、6.23%、0.48%。酯類物質(zhì)香味清淡，散逸快，是醬油中種類最復(fù)雜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要由各種有機(jī)酸和醇類發(fā)生酯化反應(yīng)而形成。5種醬油酯類化合物相對含量差距較大，在0.24%～9.36%之間。醛酮類是醬油中種類較為豐富的一類物質(zhì)，醛類呈辛辣刺激性氣味，在醬油香氣中起調(diào)和作用[17]。苯乙醛是5種醬油共有的醛類化合物，具有風(fēng)信子、紫丁香樣的香氣，苯甲醛是4號鮮味醬油特有的香氣成分，有似于杏仁的芳香氣味。酸類物質(zhì)在醬油中含量很少，有刺激性氣味。本研究僅在4號醬油中檢出3.34%的苯甲酸。雜環(huán)類化合物共檢測出21種，包括呋喃類、吡咯類、吡嗪類化合物及氰化芐。2-乙酰基吡咯是1，3號醬油的主要香氣成分，含量分別達(dá)50.76%、44.23%。2-乙?；量лp微香豆素的香氣，還有茶味香味，味甜。含硫類物質(zhì)可能與某些氨基酸的降解作用有關(guān)，共檢出3種。

3.2 電子鼻對5種釀造醬油的氣味分析

利用電子鼻PCA方法對5種醬油的氣味進(jìn)行分析，見圖1。

圖1 不同種類醬油的PCA分析圖Fig.1 PCA analysis diagram of different kinds of soy sauce

由圖1可知，主成分PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為97.42%和1.32%，總貢獻(xiàn)率達(dá)98.74%，說明可以代表醬油的整體信息。2號、4號和5號醬油之間完全沒有重疊，說明這3種醬油差異較大，相互之間很容易區(qū)分。1號特級草菇老抽和3號一級草菇老抽醬油之間有小部分重疊，說明這兩種醬油差異較小，其氣味有一定的相似性，不易區(qū)分。結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果可知，1號和3號醬油中的揮發(fā)性物質(zhì)成分較為相似。

3.3 全自動(dòng)氨基酸分析儀對5種醬油游離氨基酸含量比較

采用全自動(dòng)氨基酸分析儀對5種醬油中的17種氨基酸含量進(jìn)行測定分析。由于質(zhì)量和級別不同，醬油中的氨基酸含量也不盡相同，測定結(jié)果見表3。

表3 不同醬油中游離氨基酸的含量 Table 3 The content of free amino acids in different kinds of soy sauce g/dL

注：“-”表示未檢測到或不存在；“*”表示必需氨基酸。

谷氨酸作為特征氨基酸，根據(jù)其占總氨基酸的比例可以初步判斷是否添加了鮮味劑。釀造醬油中的谷氨酸占總氨基酸的比例一般在18%～25%左右，如果超過這個(gè)比例，則認(rèn)為可能是添加了谷氨酸鈉作為增鮮劑。5種醬油谷氨酸含量占總氨基酸的比例分別是51.59%、61.77%、27.02%、67.59%和60.76%，釀造醬油中的谷氨酸占總氨基酸的比例一般在18%～25%左右，因此可以判斷5種醬油均添加了谷氨酸鈉作為增鮮劑，與其配料表一致。

在排除谷氨酸的干擾下，5種醬油氨基酸占氨基酸總量的比值見圖2。

不計(jì)谷氨酸含量，5種釀造醬油各氨基酸含量相對分布均勻。其中，天冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸含量最高，占9%～13%；絲氨酸、丙氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸含量較均勻，占7%～9%；甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸占氨基酸總量的4%～7%；蛋氨酸、組氨酸、精氨酸含量較低，比例約在1%～4%之間。不含谷氨酸，5種醬油樣品中必需氨基酸占氨基酸總量分別為24.66%、19.61%、36.75%、16.34%、20.95%。理想蛋白質(zhì)中必需氨基酸與氨基酸總量的比值為40%左右，因此，3號醬油中的氨基酸組成相對較好。

圖2 5種醬油游離氨基酸含量占氨基酸 總量的比值(不含谷氨酸)Fig.2 Ratio of free amino acids content to total amino acids content in five kinds of soy sauce (excluding glutamic acid)

4 結(jié)論

利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對5種市售釀造醬油的香氣成分進(jìn)行鑒定，共檢測出63種香氣物質(zhì)，不同醬油的香氣成分種類及含量存在一定的差異。1號特級草菇老抽和3號一級草菇醬油的主體風(fēng)味物質(zhì)是有堅(jiān)果香和果香的2-乙?；量?；2號金標(biāo)醬油、4號鮮味生抽、5號味極鮮的主體風(fēng)味物質(zhì)是有特殊香氣的乙醇。根據(jù)PCA分析結(jié)果可知，5種醬油存在一定的差異，采用電子鼻可以對其進(jìn)行很好地區(qū)分。采用全自動(dòng)氨基酸分析儀對醬油中氨基酸的含量和組成進(jìn)行分析，谷氨酸作為醬油中最主要的鮮味氨基酸，根據(jù)其含量范圍可以初步判定5種釀造醬油都添加了增鮮劑。不計(jì)谷氨酸，5種醬油各氨基酸含量相對分布均勻。其中，3號醬油中的氨基酸組成相對最好。本研究表明HS-SPME/GC-MS、電子鼻可以綜合評價(jià)醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)合氨基酸分析儀可以更全面、快速地評價(jià)醬油的品質(zhì)。