周 琳，申加枝，段 玉，王 婷，王玉花，朱旭君，馬媛春，房婉萍

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所, 江蘇 南京 210095；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所, 上海 201403)

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是深入研究植物響應(yīng)逆境脅迫的重要工具之一[1]，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，其在植物逆境脅迫研究上的應(yīng)用也越來越深入和廣泛。雖然，近年來蛋白質(zhì)組學(xué)中同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)在動(dòng)植物研究中備受關(guān)注，但雙向凝膠電泳技術(shù)(Two-Dimensional Gel Electrophoresis，2-DE)作為蛋白質(zhì)組學(xué)的常用技術(shù)之一，在動(dòng)物、植物和微生物等研究領(lǐng)域的應(yīng)用仍較為廣泛[2]。蛋白雙向電泳體系因其準(zhǔn)確度、靈敏度和可重復(fù)性較好，對(duì)于不同物種逆境脅迫下差異蛋白的篩選和分析具有重要意義。因此，蛋白雙向電泳體系作為基礎(chǔ)，其建立及優(yōu)化一直備受關(guān)注[1,3—5]。

茶樹Camellia sinensis 為山茶科山茶屬多年生常綠經(jīng)濟(jì)作物，喜溫暖濕潤氣候。近年來，春季的“霜凍”和“倒春寒”低溫災(zāi)害及夏秋季的高溫、干旱和強(qiáng)光等災(zāi)害，顯著降低了茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[6—7]。利用2-DE 技術(shù)開展低溫、干旱等逆境脅迫下差異蛋白分析，可為深入研究茶樹對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。近年來，茶樹2-DE 體系的建立和優(yōu)化備受關(guān)注，包括蛋白樣品制備[8]、不同組織的體系建立[9—10]，以及逆境脅迫的差異蛋白分析[11]。目前，不同研究使用的茶樹品種不同，包括‘安徽一號(hào)’[8]、‘毛蟹’[10]、‘鐵觀音’[11]等。近年來，國家級(jí)茶樹良種‘迎霜’因其較強(qiáng)的抗性而備受歡迎，也是較好的試材。雖然任燕等[9]以‘迎霜’雌蕊為材料，建立其總蛋白質(zhì)分離雙向電泳體系，但該品種葉片2-DE 體系構(gòu)建尚未有報(bào)道。

對(duì)于不同的物種、組織和處理?xiàng)l件，其蛋白質(zhì)組分和理化成分不同[1—3,8—11]。因此，2-DE 沒有統(tǒng)一的廣譜體系，必須根據(jù)材料和具體處理方法，篩選合適的蛋白提取和雙向電泳條件。本研究以茶樹品種‘迎霜’的一芽二、三葉為材料，篩選提取方法，對(duì)雙向電泳的IPG 膠條選擇、上樣量、分離膠濃度、染色方法進(jìn)行條件優(yōu)化，建立適于‘迎霜’葉片的2-DE 體系，并應(yīng)用于低溫和干旱脅迫下差異蛋白初步分離，為‘迎霜’茶苗在逆境脅迫下蛋白表達(dá)差異的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)于2011 年10 月至2012 年3 月開展，以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所栽培的一年生‘迎霜’和‘安吉白茶’茶苗為材料，栽培方法參照李磊等[12]，取健壯植株的一芽二、三葉，稱重后，迅速放入液氮，立即貯存于-80 ℃冰箱用于2-DE 體系建立。另取4 ℃低溫處理和聚乙二醇6000(PEG 6000)模擬干旱脅迫處理12 h 的‘迎霜’一芽二、三葉片，用于2-DE 體系的驗(yàn)證和應(yīng)用。

1.2 方法

1.2.1 茶樹葉片蛋白提取 蛋白提取方法分別使用TCA-丙酮沉淀法和改良Tris-HCl 抽提法。TCA-丙酮沉淀法操作步驟參照郭春芳等[11]提取‘鐵觀音’葉片的方法。參照李勤等[8]、谷瑞升等[13]的改良Tris-HCl抽提法，并對(duì)部分試劑用量和操作時(shí)間進(jìn)行改良，研磨時(shí)添加交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP) 0.3 g；4 ℃溫控?fù)u床震蕩浸提1.5 h；冷丙酮和80%冷丙酮洗滌各3 次。兩種提取方法均采用低溫真空冷凍干燥，隨后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 蛋白質(zhì)沉淀的溶解和含量測(cè)定 蛋白質(zhì)沉淀的溶解參照任燕等[9]方法；蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford 法[14]。

1.2.3 蛋白雙向電泳

1.2.3.1 第一向等電聚焦(IEF) 第一向等電聚焦使用設(shè)備和操作步驟參照任燕等[9]方法，針對(duì)葉片的特征，調(diào)整等電聚焦程序，具體程序見表1。使用17 cm (pH 4～7)線性膠條(上樣量為1.6 mg)，比較2 種蛋白質(zhì)提取方法的提取效果；利用TCA-丙酮法提取的蛋白質(zhì)，使用17 cm 的pH 3～10、4～7 和5～8膠條(上樣量為1.6 mg)，比較不同pH 范圍膠條的蛋白質(zhì)分離效果；使用17 cm (pH 4～7)線性膠條比較不同上樣量(1.0、1.6、1.8 和2.2 mg)的分離效果。

1.2.3.2 IPG 膠條的平衡和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

IPG 膠條的平衡、聚丙烯酰胺凝膠配制和電泳，使用的試劑、設(shè)備以及操作步驟均參照任燕等[9]的方法，并比較不同SDS-PAGE 膠濃度(12.5%、13.5%)對(duì)蛋白質(zhì)分離的效果。

表1 等電聚焦電泳程序Table 1 Isoelectric focusing (IEF) procedure

1.2.4 染色方法 參考Blue-silver 法[14]和Wang 等[15]高敏考馬斯亮藍(lán)R-250 染色法。

1.2.5 凝膠掃描和分析 使用Bio-Rad-GS800 掃描儀進(jìn)行圖像采集，利用PDQuest 8.0.1 軟件進(jìn)行2-DE圖譜分析，使用Excel 2007 和SPSS 16.0 對(duì)不同處理的蛋白點(diǎn)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)2-DE 的影響

TCA-丙酮沉淀法和改良Tris-HCl 法提取蛋白質(zhì)的得率分別為40.56±0.53 mg·g-1、10.87±0.66 mg·g-1，可見TCA-丙酮沉淀法獲得的蛋白量較多。2 種提取方法獲得的蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜如圖1 所示。上樣量為1.6 mg時(shí)，相同電泳條件下， TCA-丙酮沉淀法、改良Tris-HCl 法分別獲得778±23 個(gè)、835±19 個(gè)蛋白點(diǎn)，改良Tris-HCl 法獲得的蛋白點(diǎn)數(shù)略高于TCA-丙酮沉淀法；Tris-HCl 法提取的蛋白雙向電泳效果更好，獲得的蛋白點(diǎn)形狀規(guī)則，背景清晰，更適用于差異蛋白的分析。由此可見，采用TCA-丙酮沉淀法和Tris-HCl 法均可進(jìn)行茶苗葉片總蛋白的提取，但為便于建立茶樹葉片蛋白雙向電泳體系，本實(shí)驗(yàn)后期蛋白提取方法采用TCA-丙酮法，以方便多次重復(fù)。

2.2 IPG 膠條pH 范圍對(duì)2-DE 的影響

由圖2 可見，IPG 膠條pH 為3～10 時(shí)，茶樹葉片蛋白質(zhì)大部分集中在pH 3～8 之間；pH 3～4 之間的蛋白質(zhì)點(diǎn)高度集中且存在重疊，使得大部分蛋白質(zhì)點(diǎn)不能有效區(qū)分，極大影響2-DE 的分辨率。采用pH 5～8 的IPG 膠條，蛋白在pH 5～6 內(nèi)的堆積不利于分離；同時(shí)與pH 3～10 的膠條一樣，在pH≥8 處蛋白點(diǎn)較少。在IPG 預(yù)制膠條pH 范圍為4～7 時(shí)，集中在pH 5～7 之間蛋白質(zhì)點(diǎn)得到了有效分離，明顯提高了雙向電泳的分辨率(圖2: B)。因此，在不改變膠條長度情況下，選擇pH 4～7 的IPG 膠條能使茶樹葉片中大量蛋白質(zhì)得到有效分離，且分辨率較高，利于后續(xù)分析。

圖1 不同提取方法對(duì)茶樹葉片蛋白雙向電泳的影響Fig. 1 Effects of different extraction methods on 2-DE maps of leaf protein A. TCA-丙酮沉淀法；B. 改良Tris-HCl 提取法

圖2 IPG 膠條pH 范圍對(duì)茶樹葉片蛋白雙向電泳的影響Fig. 2 Effects of different pH gradients of IPG strip on 2-DE maps of leaf protein A. pH 3～10；B. pH 4～7；C. pH 5～8

2.3 上樣量對(duì)2-DE 的影響

為獲取最佳蛋白上樣量，以TCA-丙酮法提取的‘迎霜’葉片蛋白干粉為材料，選擇17 cm pH 4～7 IPG膠條，分別用1.0、1.6、1.8 和2.2 mg 上樣量進(jìn)行雙向電泳。利用PDQuest 8.0.1 軟件分析后，4 個(gè)不同上樣量處理的2-DE 圖譜中，檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)分別為516±19 個(gè)、789±21 個(gè)、1069±17 個(gè)和1286±29 個(gè)(圖 3)。由圖3: A 可見，上樣量為1.0 mg 時(shí)，圖譜中有效蛋白點(diǎn)數(shù)少且分辨率較低；上樣量為1.6、1.8 和2.2 mg 時(shí)(圖3: B,C,D)，隨著上樣量的增加，圖譜中蛋白質(zhì)點(diǎn)也隨著增加，圖譜中有效蛋白點(diǎn)數(shù)較多，且能有效分離。因此，‘迎霜’葉片蛋白雙向電泳適宜的上樣量在1.6～2.2 mg 間。

2.4 分離膠濃度對(duì)2-DE 的影響

如圖4 所示，上樣量為1.6 mg，SDS-PAGE 膠濃度為12.5%時(shí)，2-DE 圖譜上茶苗葉片蛋白點(diǎn)分離不夠清晰，膠中上部的蛋白質(zhì)點(diǎn)可有效分離，而膠下部的蛋白質(zhì)點(diǎn)則重疊，總蛋白質(zhì)整體分離效果欠佳；當(dāng)濃度為13.5%時(shí)，小分子蛋白充分分離，且蛋白點(diǎn)均勻分布在整個(gè)膠面內(nèi)，背景清晰，沒有重疊的蛋白點(diǎn)，表明分離‘迎霜’茶苗葉片蛋白分離膠的適宜濃度為13.5%。

圖3 上樣量對(duì)茶樹葉片蛋白雙向電泳的影響Fig. 3 Effects of sample loading on 2-DE maps of leaf protein A.1.0 mg；B.1.6 mg；C.1.8 mg；D. 2.2 mg

圖4 分離膠濃度對(duì)茶樹葉片蛋白雙向電泳的影響Fig. 4 Effects of different gels on 2-DE maps of leaf protein A.12.5%分離膠；B.13.5%分離膠

2.5 染色方法對(duì)2-DE 的影響

由于上樣量為1.6 mg，不宜使用銀染法，因此比較兩種考馬斯亮藍(lán)染色法(Blue-silver 法、高敏考馬斯亮藍(lán)R-250 法)對(duì)雙向電泳效果的影響。染色后，高敏考馬斯亮藍(lán)R-250 法總點(diǎn)數(shù)為809±15 個(gè)，Blue-silver 法總點(diǎn)數(shù)為677±21 個(gè)；高敏考馬斯亮藍(lán)R-250 法總體背景較清晰，分辨率高，且獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)量顯著高于Blue-silver 法(圖5)?？梢?，高敏考馬斯亮藍(lán)R-250 法比Blue-silver 法更適合于‘迎霜’葉片蛋白質(zhì)的染色。

2.6 2-DE 體系的應(yīng)用

基于前期體系的建立，采用Tris-HCl 法提取‘迎霜’和‘安吉白茶’茶苗葉片總蛋白，選用17 cm pH 4～7 IPG 膠條，使用1.6 mg 上樣量、13.5%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，最終用高敏考馬斯亮藍(lán)R-250法進(jìn)行染色，‘迎霜’和‘安吉白茶’葉片分別獲得819±17、878±19 個(gè)清晰的蛋白質(zhì)點(diǎn)，表明建立的2-DE 體系適用于不同茶樹品種。采用相同體系，分別對(duì)低溫和干旱脅迫12 h 的‘迎霜’茶苗葉片總蛋白進(jìn)行雙向電泳，可分別分離到856±13 個(gè)和1129±21 個(gè)蛋白點(diǎn)。由圖6 可見，低溫和干旱脅迫處理下的葉片蛋白質(zhì)點(diǎn)充分分離且背景清晰、分辨率高，可用于差異蛋白分析、篩選、挑取和檢測(cè)。

3 結(jié)論與討論

圖5 染色方法對(duì)葉片蛋白雙向電泳的影響Fig. 5 Effects of different staining methods on 2-DE maps of leaf protein A.Blue-silver 法；B.高敏考馬斯亮藍(lán)R-250 法

樣品制備方法、膠條的選擇、上樣量、分離膠濃度以及染色方法等，均影響雙向電泳的分辨率、蛋白質(zhì)的分離效果、差異蛋白的篩選等，是蛋白質(zhì)雙向電泳的關(guān)鍵技術(shù)。蛋白質(zhì)樣本的制備是實(shí)驗(yàn)的第一步，由于茶樹中富含次生代謝產(chǎn)物，且在逆境脅迫下，其可溶性物質(zhì)如可溶性蛋白、可溶性糖、游離脯氨酸等含量顯著增加[6—7,12]，極易影響2-DE 效果。李勤等[8]研究表明，TCA-丙酮沉淀法蛋白質(zhì)提取效率較高，在本實(shí)驗(yàn)中該方法提取效率顯著高于Tris-HCl 法；然而，也有研究表明，TCA-丙酮沉淀法極易因不能有效去除次生代謝產(chǎn)物和鹽分，導(dǎo)致蛋白質(zhì)點(diǎn)的分離受到干擾，最終獲得的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)少且橫縱條紋較多[17—18]。本實(shí)驗(yàn)采用TCA-丙酮沉淀法和Tris-HCl 法所獲得的蛋白質(zhì)除了蛋白點(diǎn)有差異外，其他差異并不顯著，且不存在橫縱條紋嚴(yán)重等問題，這可能與物種、品種和取樣部位相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)使用的材料為一年生茶苗的一芽二、三葉，蛋白質(zhì)提取過程中受干擾的因子少，且改良Tris-HCl 法提取時(shí)，針對(duì)茶樹次生代謝產(chǎn)物較多，將PVPP 增加至0.3 g；為提高提取效率，4 ℃溫控?fù)u床震蕩浸提時(shí)間延長至1.5 h；為降低鹽分和雜質(zhì)，冷丙酮和80%冷丙酮洗滌次數(shù)增加至3 次。

膠條長度、pH 范圍、上樣量、分離膠濃度和染色方法決定蛋白質(zhì)可否有效分離以及2-DE 圖像的分辨率，同時(shí)，這幾項(xiàng)條件之間也存在著相關(guān)性。例如，膠條長度決定著上樣量，上樣量決定分離膠濃度和染色方法(過高上樣量不適用于銀染法)。因此，優(yōu)化各項(xiàng)指標(biāo)，可提高雙向電泳的分辨率、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，有利于后續(xù)差異蛋白的篩選和質(zhì)譜驗(yàn)證。膠條的選擇，需要兼顧總蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)點(diǎn)的分離效果。本研究比較了17 cm 的pH 3～10、4～7 和5～8 膠條對(duì)蛋白質(zhì)的分離效果，結(jié)果顯示葉片蛋白集中在pH 4～7 間，與茶樹品種‘毛蟹’[10]、‘鐵觀音’[11]研究結(jié)果一致。這可能是與植物葉片蛋白絕大多數(shù)集中在pH 4～7 間[19—20]，且堿性蛋白分離較為困難有關(guān)。上樣量決定著差異蛋白分離的準(zhǔn)確性和有效性，本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于‘迎霜’茶苗葉片而言，上樣量為1.6～2.2 mg 較為合適。與以往研究相比[8,10—11]，上樣量較大，樣品中鹽離子濃度可能會(huì)偏高，因此調(diào)整了等電聚焦的程序。等電聚焦程序上，先在低電壓下(100、200、400、600、1000 和4000 V)進(jìn)行，使樣品中的鹽離子充分移動(dòng)到膠條兩極，然后在8000 V 恒定電壓下聚焦。蛋白質(zhì)樣品在60 000Vh 的情況下能得到充分地聚焦。分離膠濃度會(huì)影響蛋白質(zhì)分離的程度和清晰度，濃度過高或過低均會(huì)影響蛋白質(zhì)分離效果，降低差異蛋白的篩選效率[21]。本研究比較了12.5%和13.5%分離膠的分離效果，最終選擇13.5%的分離膠濃度作為最適濃度，可使蛋白得到有效分離。目前，常規(guī)銀染方法雖靈敏度高且已被廣泛使用，但其步驟繁瑣、染色條件亦難控制，且對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析有干擾[22]；近年來大量研究中使用考馬斯亮藍(lán)染色法[23—26]，與銀染法相比，其更為簡(jiǎn)便且適用于質(zhì)譜分析。本研究使用高敏考馬斯亮藍(lán)R-250 染色法，獲得的2-DE 圖譜蛋白點(diǎn)較多且清晰，適于上樣量1.6 mg 的葉片蛋白質(zhì)。

圖6 低溫和干旱脅迫下葉片蛋白雙向電泳Fig. 6 2-DE maps of leaf protein under cold and drought stress A.低溫脅迫(4℃, 12 h)；B.干旱脅迫(PEG6000, 12 h)

本研究表明，采用TCA-丙酮法或Tris-HCl 法提取‘迎霜’葉片總蛋白，選用17 cm pH 4～7 IPG膠條，選擇1.6～2.2 mg 上樣量，13.5%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，使用高敏考馬斯亮藍(lán)R-250 法進(jìn)行染色，能較為有效地分離‘迎霜’茶苗葉片各分子量的蛋白，獲得分辨率高、背景清晰、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜，該雙向電泳體系既適用于正常生長的葉片，也適用于低溫和干旱脅迫的茶樹葉片蛋白質(zhì)雙向電泳分析，可用于低溫和干旱脅迫下茶樹差異蛋白分析。