馬陳皋，毛立祺，應 笑，王爽爽，李 蒙，張 璐，王 曦，呂 賓

馬陳皋，毛立祺，應笑，王爽爽，李蒙，張璐，王曦，呂賓，浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院消化內科，浙江省消化系統(tǒng)疾病病理生理重點實驗室 浙江省杭州市 310006

核心提要：本研究通過對比模型組和對照組實驗動物腸系膜淋巴結樹突狀細胞(mesenteric lymph node dendritic cells，MLNDC)的活性差異、蛋白質二硫鍵異構酶A3(protein disulfide isomerase A3，PDIA3)和磷酸化-信號轉導與轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)的表達差異，提示內臟高敏感的發(fā)生或許和PDIA3對STAT3通路的抑制所引起的MLNDC的異常免疫活化有關.

0 引言

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是世界范圍內的多發(fā)病[1]，但是其發(fā)病機制目前尚不明確.近年來，腸道免疫異常在IBS發(fā)生過程中的作用受到了越來越多的關注.我們的前期研究顯示，IBS大鼠腸道樹突狀細胞(dendritic cells，DC)數(shù)量增加[2]，細胞表面主要組織相容性復合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHC-Ⅱ)類分子表達增加，激活T淋巴細胞的能力顯著增強[3]，說明其可能通過自身的活化，參與腸道免疫異常的發(fā)生，并最終引起IBS內臟高敏感.

信號轉導與轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)通路在不同的細胞中發(fā)揮著多種不同的調節(jié)功能.在DC中，STAT3通路的激活會對DC的活化產生明確的抑制作用[4].蛋白質二硫鍵異構酶A3(protein disulfide isomerase A3，PDIA3)主要位于內質網(wǎng)中，以分子伴侶形式參與新生蛋白質的加工處理及質量監(jiān)控.多項研究表明PDIA3可以參與STAT3通路的激活調控[5-9].

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PDIA3在應激IBS大鼠以及IBS患者腸黏膜病理標本中的表達明顯高于對照組[10].結合PDIA3對STAT3通路的調節(jié)功能及STAT3通路在DC活化中發(fā)揮的關鍵性作用，我們假設：IBS模型動物腸道DC的異常免疫活化或許和STAT3通路的抑制以及PDIA3的高表達有關.

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物：C57BL/6小鼠、Balb/c小鼠購自浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心.

主要試劑：RPMI1640、胎牛血清購自Sigma公司；2-巰基乙醇(2-ME)、磷酸鹽緩沖液(phosphate belanced solution，PBS)購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司；組織細胞裂解液、ECL試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl amino ester，CFSE)購自美國賽默飛世爾科技公司；抗PDIA3抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自美國CST公司；流式抗體：FITC標記的CD11c抗體、APC標記的MHC-Ⅱ抗體購自美國ebioscience公司；小鼠初始CD4陽性T淋巴細胞分選試劑盒、小鼠CD11c陽性樹突狀細胞分選試劑盒購自美天旎生物技術有限公司；免疫染色固定液、免疫染色強力通透液、免疫染色封閉液、抗熒光淬滅封片劑購自上海碧云天生物技術有限公司.實驗取得動物倫理委員會批準(ZSLL-2018-037).

1.2 方法

1.2.1 內臟高敏感小鼠建模：參考Williams等[11]和Zheng等[12]的方法，對小鼠造成人為的束縛應激，使其內臟敏感性增加，具體如下：模型組小鼠20只，雄性，6-8 wk，體重21 g±2 g，造模過程采用束縛器限制小鼠上半身、前肩及前肢的自由活動，主要限制其前肢對頭面部的清理動作，對其造成慢性應激.每日08：00-10：00造模，持續(xù)1 h，連續(xù)14 d.造模結束3 d后小鼠禁食不禁水12 h，隨后對小鼠實行結直腸擴張(colorectal distension，CRD)試驗，然后用國際通用的腹部收縮反射評分[13]評價CRD后小鼠的內臟敏感性，具體如下：將石蠟潤滑后的CRD裝置插入小鼠肛門，用膠布固定于鼠尾部，讓小鼠適應該裝置15 min.然后對裝置中的氣囊注水，使小鼠結腸被動擴張，觀察記錄小鼠腹肌收縮、背部拱起時所注入的水量，為小鼠的擴張容量閾值，同一小鼠重復3次，間隔4 min，取平均值.

1.2.2 小鼠MLNDC的提?。焊鶕?jù)Van den Broeck等[14]對于小鼠腸系膜淋巴結分布的描述摘取小鼠腹腔腸系膜淋巴結，具體如下：將小鼠頸椎脫臼處死，于75%酒精浸泡10 min，然后無菌環(huán)境下剖開小鼠腹腔，找到小鼠盲腸，在升結腸與橫結腸交界處的腸系膜根部可以找到空腸淋巴結以及結腸淋巴結共2-4顆.用無菌玻璃板對所獲得的淋巴結進行碾磨，收集獲得的淋巴細胞懸液，過400目濾網(wǎng)除去纖維組織以及細胞團塊.按美天旎CD11c陽性樹突狀細胞分選試劑盒里的說明手冊進行樹突狀細胞的分離，具體如下：將所獲得的淋巴細胞懸液300 r/min離心10 min，每1×108個細胞用400 μL磁珠分選緩沖液重懸，加入100 μL CD11c磁珠，4 ℃孵育10 min；加入10 mL預冷的磁珠分選緩沖液，300 r/min離心10 min去除未結合的磁珠，1 mL磁珠分選緩沖液重懸，上磁珠架，收集CD11c陽性MLNDC備用.

1.2.3 流式細胞術檢測細胞表型：取少量上述MLNDC單細胞懸液于1.5 mL EP管，300 r/min離心10 min，去上清，100 μL流式上樣緩沖液重懸細胞，加入對應的流式抗體，室溫孵育15 min，加入1 mL PBS，300 r/min離心10 min，去上清，500 μL流式上樣緩沖液重懸，上機檢測.

1.2.4 蛋白印記實驗(western blot，WB)：按照Burnette等[15]提供的實驗步驟進行WB.具體如下：(1)細胞總蛋白的提?。?00 r/min，4 ℃離心10 min收集上述MLNDC單細胞懸液，預冷PBS洗2次.加入5倍于細胞沉淀體積的組織細胞裂解液，冰上裂解15 min，每隔5 min振蕩1 min.12000 g，4 ℃離心10 min，轉移富含蛋白的上清到新EP管.加入1/2體積的上樣緩沖液，加入1/30體積的二硫蘇糖醇，混勻，水浴鍋99 ℃加熱5 min，冰上冷卻，獲得蛋白樣品，-80 ℃冰箱保存.(2)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：安裝好電泳裝置，將蛋白樣品按預先計算所得的上樣量加到凝膠凹槽中，接通電源，電泳時，濃縮膠電壓70 V，分離膠電壓120 V.酚紅到達分離膠的底部后停止電泳.(3)轉膜：取出電泳后的凝膠，切去多余部分，取預先轉移緩沖液濕潤3張轉印濾紙，將上述凝膠置于其上，再將PVDF膜置于凝膠上，最后將另外3張轉印濾紙蓋于PVDF膜上，用夾子夾好后，置入電轉移系統(tǒng)，接通電源，300 mA恒定電流轉移2 h，期間保持低溫.(4)免疫檢測：用5%的脫脂牛奶常溫封閉轉膜結束后的PVDF膜2 h，根據(jù)抗體說明書上描述分子量切下對應條帶，置于1：4000稀釋后的抗PDIA3抗體、抗磷酸化-信號轉導與轉錄激活因子3(phosphorylated signal transduction and activator of transcription 3，P-STAT3)抗體以及抗GAPDH抗體緩沖液中孵育，4 ℃搖床過夜.TBST洗3次，5 min/次.1：4000稀釋后的抗兔二抗或抗鼠二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次.將ECL發(fā)光液均勻覆蓋PVDF膜，上機曝光、顯影.條帶結果用Image Lab軟件進行分析.PDIA3蛋白表達量用其與GAPDH蛋白對應條帶的積分光密度值(integral optical density，IOD)的比值來表示、P-STAT3蛋白表達量用其與非磷酸化的STAT3蛋白對應條帶的IOD的比值來表示.

1.2.5 免疫熒光技術：用免疫熒光技術對PDIA3與P-STAT3進行亞細胞定位，具體如下：調整上述獲得的MLNDC細胞懸液濃度至1×106個/mL，取100 μL于1.5 mL EP管中，PBS洗2次，重懸后加入到甩片機中，3000 r/min，10 min制成細胞甩片.免疫染色固定液室溫固定10 min，PBS洗3次，5 min/次，免疫染色強力通透液室溫通透10 min，免疫染色封閉液室溫封閉1 h，1：200兔來源抗PDIA3抗體、1：200鼠來源抗P-STAT3抗體4 ℃孵育過夜，PBS洗脫3次，F(xiàn)ITC標記的山羊抗鼠抗體以及CY3標記的山羊抗兔抗體室溫孵育1 h，PBS洗3次，含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)抗熒光淬滅封片劑封片，共聚焦顯微鏡觀察、拍照.熒光圖片采用Image J進行分析，結果以綠色或紅色熒光的平均光密度(mean optical density，MOD)來表示.

1.2.6 磁珠分選初始T淋巴細胞：按照磁珠分選試劑盒說明書進行操作，具體如下：提取Balb/c小鼠脾臟細胞，計數(shù)，每107個細胞進行如下處理：加入40 μL預冷磁珠分選緩沖液，10 μL抗體cocktail，冰上孵育5 min，加入額外的20 μL磁珠分選緩沖液，20 μL磁珠，冰上孵育10 min，加入200 μL磁珠分選緩沖液，300 r/min，4 ℃離心10 min去除未結合細胞的抗體和磁珠.磁珠分選緩沖液重懸，上分選架.

1.2.7 混合淋巴細胞反應：(1)對上述初始T淋巴細胞進行細胞內染色標記：取分選所得初始T淋巴細胞，用PBS調整細胞濃度為5×106個/mL，加入CFSE，工作濃度為1.5 μmol/L，37 ℃培養(yǎng)箱孵育15 min，每5 min振蕩1次.加入預冷的完全培養(yǎng)基終止反應，300 r/min離心10 min，去除上清多余染料；(2)調整染色后的初始T淋巴細胞濃度為106個/mL，取100 μL加入弧形底96孔板；(3)將上述獲得的模型組及對照組MLNDC密度均調整為2×106個/mL，以DC：T比例為1：1加入對應量的MLNDC細胞懸液，最后加入完全培養(yǎng)液調整每孔終體積至200 μL.2 d后流式檢測初始T淋巴細胞增殖情況.

統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析.正態(tài)分布的計量資料以mean±SD表示，兩組獨立樣本比較采用t檢驗，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 小鼠的一般情況及模型驗證 對照組小鼠一般情況良好.模型組小鼠逐漸出現(xiàn)焦慮、煩躁，出現(xiàn)重復刻板行為，體重減輕，大便偏稀，肛門口大便污染.造模結束3 d后，對小鼠進行模型驗證，以模型組、對照組小鼠的擴張容量閾值作為評價指標.結果模型組小鼠的內臟敏感性顯著高于對照組[(0.53 mL±0.07 mL)vs(0.85 mL±0.12 mL)，t=-10.845，P=0.000].

2.2 流式檢測小鼠MLNDC的分離情況 收集磁珠分離得到的MLNDC，流式鑒定CD11c陽性MLNDC細胞比例為86.61%±7.02%，臺盼藍染色后相差顯微鏡下觀察計數(shù)顯示所獲得的DC活性大于95%.

2.3 流式檢測MLNDC表面MHC-Ⅱ類分子表達情況 如圖1，模型組小鼠MLNDC細胞表面MHC-Ⅱ類分子表達高于對照組[(73.08%±2.64%)vs(53.20%±4.50%)，t=-7.617，P=0.000].

2.4 WB檢測MLNDC中PDIA3、P-STAT3蛋白的表達量模型組MLNDC中PDIA3表達量明顯高于對照組[(0.77±0.04)vs(0.42±0.03)，t=11.086，P=0.000]；P-STAT3表達量顯著降低[(0.73±0.03)vs(1.24±0.18)，t=-4.737，P=0.038)](圖2).

2.5 免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測PDIA3、P-STAT3蛋白在MLNDC中的定位及含量 小鼠MLNDC中PDIA3和P-STAT3多分布于細胞膜上(圖3)；相比較于對照組，模型組P-STAT3對應的綠色熒光的MOD降低[(0.0358±0.0036)vs(0.0745±0.0119)，t=-17.782，P=0.000]，與此同時，與PDIA3對應的紅色熒光的MOD升高[(0.0639±0.0142)vs(0.0567±0.0003)，t=8.758，P=0.013].

2.6 流式檢測混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)中小鼠CD4陽性T淋巴細胞的增殖情況 如圖4，未加入BMDC的反應孔(BMDC：T=0：1)初始T淋巴細胞幾乎不出現(xiàn)增殖；加入模型組MLNDC的MLR體系中，初始T細胞的增殖細胞百分比高于對照組(control)，差異有統(tǒng)計學意義([(34.24%±2.95%)vs(17.22%±3.47%)，t=6.472，P=0.003].

圖1 對照組、模型組小鼠腸MLNDC表面MHC-Ⅱ類分子表達情況, 模型組小鼠MLNDC表面MHC-Ⅱ類分子表達高于對照組.MLNDC：腸系膜淋巴結樹突狀細胞；MHC-Ⅱ：主要組織相容性復合體Ⅱ；Control：對照組；Restraint stress：模型組.

圖2 對照組、模型組小鼠腸系膜淋巴結樹突狀細胞中PDIA3、P-STAT3蛋白表達情況, 模型組小鼠MLNDC中PDIA3表達升高、P-STAT3表達減少.PDIA3：蛋白質二硫鍵異構酶A3；GAPDH：抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶；P-STAT3：抗磷酸化-信號轉導與轉錄激活因子3；STAT3：信號轉導與轉錄激活因子3.

3 討論

IBS的發(fā)病率逐年增高，近來，免疫失衡在IBS的發(fā)病過程中的作用引起了越來越多的關注，DC作為機體免疫系統(tǒng)的核心，廣泛分布于胃腸道中，在免疫失衡引起的IBS內臟高敏感中發(fā)揮重要作用.

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IBS模型組MLNDC中MHC-Ⅱ類分子表達增加，同時激活T淋巴細胞的能力增強[3].在此基礎之上，本研究進一步探索IBS模型組MLNDC異?；罨目赡軝C制.

STAT3是信號轉導與轉錄激活因子家族中重要的成員.STAT3通路是一條由細胞因子激活、眾多相關蛋白調節(jié)的信號轉導通路，廣泛參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種重要的生物學功能.通路被激活后，STAT3蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化，隨后發(fā)生二聚化，二聚體P-STAT3進入細胞核，結合對應的DNA結合序列，發(fā)揮轉錄調控的作用.大量研究表明，STAT3通路的激活，對DC的活化有明確的抑制作用[4].我們的研究發(fā)現(xiàn)，模型組MLNDC細胞表面MHC-Ⅱ分子表達增加；在MLR體系中，激活初始T細胞的能力增強；同時其內部P-STAT3的表達減弱.這提示MLNDC中STAT3通路的抑制，或許是引起DC免疫異常，并最終導致IBS內臟高敏感發(fā)生的一個可能因素.

PDIA3也被稱為Erp57或GRP58，是蛋白質二硫鍵異構酶家族的一員，主要功能是通過催化內質網(wǎng)中蛋白質二硫鍵的形成，促進合成后蛋白質的正確折疊.同時作為STAT3的伴侶蛋白，PDIA3也可以調節(jié)STAT3通路的活化[5-9].

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IBS模型動物以及IBS患者腸系膜病理標本PDIA3表達增加[10]，并且明確了PDIA3在DC介導的免疫異常所引起的IBS內臟高敏感中的作用[16].在此基礎之上，本研究試圖探索PDIA3此種作用的發(fā)揮與STAT3通路之間的相關性.我們發(fā)現(xiàn)，模型組MLNDC中P-STAT3表達減弱的同時伴隨著PDIA3的表達增高；在激光共聚焦顯微鏡下，PDIA3、P-STAT3多分布于細胞膜上，在空間上存在共定位的可能性，且模型組PDIA3對應的紅色熒光的MOD上升，而P-STAT3對應的綠色熒光MOD明顯減少.這一結果和Sehgal等[7]的研究結果相似，Sehgal等[7]認為，PDIA3和P-STAT3會共同存在于細胞膜的脂筏結構中，PDIA3的存在會抑制P-STAT3與DNA的結合.這提示PDIA3作為IBS模型組與對照組的差異蛋白，或許可以通過抑制STAT3通路，引起DC免疫異常，最終導致IBS內臟高敏感的發(fā)生.

圖3 對照組、模型組小鼠腸系膜淋巴結樹突狀細胞中PDIA3、P-STAT3蛋白的表達與分布情況, PDIA3、P-STAT3主要分布于MLNDC細胞膜, 模型組P-STAT3對應的綠色熒光的MOD降低, PDIA3對應的紅色熒光的MOD升高.DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚；PDIA3：蛋白質二硫鍵異構酶A3；P-STAT3：抗磷酸化-信號轉導與轉錄激活因子3.

圖4 對照組、模型組小鼠腸系膜淋巴結樹突狀細胞在混合淋巴細胞反應中刺激初始T淋巴細胞增殖的能力比較, 模型組比對照組表現(xiàn)出更強的刺激能力.Only T：初始T淋巴細胞；Control：對照組；Restraint stress：模型組.

關于PDIA3對于STAT3通路活化的調節(jié)，現(xiàn)有研究結果尚不一致.Coe等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的胚胎成纖維干細胞中，PDIA3和STAT3蛋白主要在內質網(wǎng)中發(fā)揮相互作用，PDIA3基因的敲除會引起P-STAT3表達增加，并且重新過表達的PDIA3必須帶有內質網(wǎng)定位序列才能逆轉這種情況，提示內置網(wǎng)中的PDIA3才是引起STAT3通路抑制的關鍵分子.另一方面，Kondo等[9]和Chichiarelli等[5]在M14黑色素瘤細胞以及HepG2肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)兩者的共定位發(fā)生于核內，PDIA3的敲低表達顯著抑制STAT3通路的活化，并且抑制了隨后的STAT3通路依賴性的C反應蛋白的表達.在我們的研究中，小鼠MLNDC中PDIA3和P-STAT3大量共存于細胞膜上，且PDIA3的表達增加伴隨著P-STAT3的表達下降以及DC活性的異常增加.

本研究尚存在一定的局限性.由于本研究為模型組與對照組的橫斷面比較研究，所以并不能充分說明PDIA3高表達與STAT3通路的抑制之間的因果關系.隨后的研究可以從改變MLNDC中PDIA3的表達量，然后觀察STAT3通路的活化情況來入手.

綜上，本實驗通過建立內臟高敏感小鼠模型，對比模型組和對照組小鼠MLNDC的活性以及其PDIA3、P-STAT3蛋白的表達差異，提示了IBS內臟高敏感小鼠MLNDC的異常免疫活化或許和PDIA3/STAT3有關，為IBS內臟高敏感的發(fā)病機制提供了新的研究思路，為進一步的治療提供了一個潛在的靶點.

文章亮點

實驗背景

蛋白質二硫鍵異構酶A3(protein disulfide isomerase A3，PDIA3)/信號轉導與轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)通路在腸系膜淋巴結樹突狀細胞(mesenteric lymph node dendritic cells，MLNDC)介導的腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)內臟高敏感發(fā)生發(fā)展中的作用還是一個未知數(shù).

實驗動機

探究PDIA3/STAT3通路在IBS內臟高敏感發(fā)生發(fā)展中的作用.

實驗目標

比較模型組和對照組小鼠MLNDC的免疫活性及其PDIA3、P-STAT3的表達和分布情況.

實驗方法

束縛應激建立IBS內臟高敏感小鼠模型，磁珠分選獲取MLNDC，用MLR和細胞表面組織相容性復合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHC-Ⅱ)的含量反映樹突狀細胞(dendritic cells，DC)的免疫活性，WB比較組間PDIA3以及P-STAT3的表達差異，免疫熒光比較兩者分布差異.

實驗結果

IBS模型組小鼠MLNDC免疫活性增強，PDIA3表達增加，但是P-STAT3表達下降.

實驗結論

PDIA3/STAT3通路或許在MLNDC介導的IBS內臟高敏感的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用.

展望前景

PDIA3/STAT3通路和IBS內臟高敏感發(fā)生發(fā)展的相關性的確立，可以為后續(xù)IBS內臟高敏感發(fā)生機制的研究提供思路，為臨床IBS內臟高敏感癥狀的治療提供新的靶點.