唐彪 周瑤瑤

巨噬細(xì)胞作為一類具有可塑性、異質(zhì)性的免疫細(xì)胞，根據(jù)周圍微環(huán)境的不同刺激可呈現(xiàn)出一系列不同的表型（主要分為M1型和M2型），即巨噬細(xì)胞的極化現(xiàn)象[1-2]。姜黃素是姜黃根中的多酚成分，具有抗氧化、抗炎、抗微生物和抗凋亡等多種藥理活性[3-5]。我們之前的研究證實(shí)姜黃素可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）聯(lián)合干擾素γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中各種炎癥因子的表達(dá)[6]。然而，姜黃素是否能影響巨噬細(xì)胞的極性及其具體的抗炎機(jī)制尚不十分明確[7]。因此，本研究擬通過觀察姜黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞的極性及炎癥因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究姜黃素對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4-MAPK/NF-κB信號(hào)通路的作用，為姜黃素在免疫調(diào)節(jié)、抗炎治療等方面提供一定的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 單核細(xì)胞株RAW264.7按照美國(guó)典型物培養(yǎng)中心（ATCC）的說明，采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將姜黃素溶于DMSO中制成濃度為100mM的濃縮液，設(shè)置不同濃度，分別為 0μmol/L（LPS組）、6.25μmol/L（姜黃素 6.25μmol/L 組）、12.5μmol/L（姜黃素 12.5μmol/L 組）、25μmol/L（姜黃素 25μmol/L組）預(yù)處理巨噬細(xì)胞2h后加入LPS（1μg/ml）。為研究TLR4-MAPK/NF-κB信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞極化中的作用，將未加入姜黃素的細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組、vector組、siTLR4組、JNK抑制劑組、ERK 抑制劑組和p38抑制劑組，后4組分別加入siTLR4、JNK抑制劑、ERK抑制劑和p38抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，用于提取細(xì)胞的蛋白質(zhì)和RNA。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 實(shí)驗(yàn)試劑包括RAW264.7巨噬細(xì)胞（中科院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)）；DMEM高糖培養(yǎng)基及FBS（美國(guó)Hyclone公司）；LPS、姜黃素（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；抗體（美國(guó)Abcam公司）；JNK 抑 制 劑 （SP600125）、ERK 抑 制 劑（SCH772984）及 p38抑制劑（SKepinone-L）（美國(guó)Selleck Chemicals公司）；一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體（美國(guó) CST公司）；CD206抗體（美國(guó)Abcam公司）；TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)MBI Fermentas公司）、Quant qRT-PCR（SYBR Green I）試劑盒（美國(guó)TIANGEN公司）；引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，其他各種化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)儀器包括層流超凈操作臺(tái)（無錫一凈公司）；LX70倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；超低溫冰箱（日本SANYO公司）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Quene公司）；RNA定量分析儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；逆轉(zhuǎn)錄PCR基因擴(kuò)增儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；Real-Time PCR儀（美國(guó)ABI公司）；凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc EZ、化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）法檢測(cè)腫瘤壞死因子α（tumornecrosis factor alpha，TNF-α）及白介素 -6（interleukin-6，IL-6）mRNA 的表達(dá)按Trizol說明書提取各組細(xì)胞的總RNA，采用紫外分光光度法檢測(cè)RNA的純度和濃度，按RT-PCR試劑盒操作步驟將各組mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件如下：65℃ 5min，42℃ 1h，70℃ 5min。同時(shí)，通過比對(duì)TNF-α及IL-6和內(nèi)參在Genebank中相應(yīng)的基因全長(zhǎng)cDNA序列分別設(shè)計(jì)引物，序列如下：TNF-α正向引物TTGCCCTGTGAGGAGGAC，反向引物TGAGCCAGAAGAGGTTGAGG；IL-6正向引物CTTCGGTCCAGTTGCCTTCT，反向引物GTGAGTGGCTGTCTGTGTGG；β-actin 正 向 引 物 CATGTACGTTGCTATCCAGGC，反向引物CTCCTTAATGTCACGCACGAT。使用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀及Quant qRT-PCR（SYBR Green I）試劑盒，以β-actin為內(nèi)參，確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線，分別得出Ct值，并采用2-ΔΔCt計(jì)算TNF-α及IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 Western blot法檢測(cè) iNOS、CD206 及p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65的總體及磷酸化水平 上述分組的巨噬細(xì)胞經(jīng)處理后，RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定各組樣品蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液煮沸備用。蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，染色洗膜后用脫脂奶粉封閉，結(jié)合一抗，室溫下?lián)u動(dòng)1h，4℃孵育過夜。經(jīng)PBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，再次洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光顯色。結(jié)果用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶的光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩獨(dú)立樣本間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組巨噬細(xì)胞M1型極化及相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-6的比較 見圖1。

圖1 各組巨噬細(xì)胞M1型極化及相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-6的比較（A：各組巨噬細(xì)胞iNOS及CD206蛋白表達(dá)的電泳圖；B：各組巨噬細(xì)胞iNOS及CD206蛋白表達(dá)水平的比較；C：各組巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)水平的比較；D：各組巨噬細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)水平的比較；與 LPS 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖1可見，與對(duì)照組相比，LPS組iNOS和CD206的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)水平也顯著升高（P＜0.05）。與LPS組相比，隨著姜黃素干預(yù)組中藥物濃度的升高，iNOS的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或0.01），而CD206的表達(dá)水平無明顯變化（均P＞0.05）；TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05或0.01）。

2.2 各組巨噬細(xì)胞TLR4及p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65表達(dá)水平的比較 見圖2。

由圖2可見，在LPS的刺激下，TLR4 mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）；另一方面，隨著姜黃素濃度的升高，TLR4 mRNA的表達(dá)水平下降（均P＜0.01）。與對(duì)照組相比，LPS組p38/ERK/JNK/IκBα/p65的磷酸化水平顯著增加（P＜0.01），而總體表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與LPS組相比，姜黃素25μmol/L組可顯著抑制LPS引起的TLR4-MAPK/NF-κB通路的激活，具體表現(xiàn)為p38/ERK/JNK/IκBα/p65磷酸化水平的回落（P＜0.05，圖2C-D）。

2.3 各組巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)水平的比較 見圖3。

由圖3可見，通過siTLR4以及下游通路關(guān)鍵分子的抑制劑分別下調(diào)相應(yīng)分子的表達(dá)，從而在不同水平阻斷該信號(hào)通路的傳導(dǎo)，與vector組相比，siTLR4能顯著降低其下游蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）；同時(shí)，JNK的抑制劑SP600125、ERK的抑制劑SCH772984以及p38的抑制劑Skepinone-L也能分別在不同水平阻斷MAPK通路的傳導(dǎo)（P＜0.05）（圖3A-B）。與vector組相比，siTLR4組巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6的表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.01）；另外，JNK的抑制劑 SP600125、ERK的抑制劑SCH772984以及p38的抑制劑Skepinone-L也能顯著降低TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)水平（P＜0.05或0.01，圖 3C）。

3 討論

圖2 各組巨噬細(xì)胞TLR4及p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65表達(dá)水平的比較（A：各組巨噬細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)的電泳圖；B：各組巨噬細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)水平的比較；C：各組巨噬細(xì)胞p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65蛋白表達(dá)的電泳圖；D：各組巨噬細(xì)胞p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65蛋白表達(dá)水平的比較；與LPS組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

圖3 各組巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)水平的比較（A：各組巨噬細(xì)胞p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p6蛋白表達(dá)的電泳圖；B：各組巨噬細(xì)胞p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p6蛋白水平的比較；C：各組巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平的比較；與LPS組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

巨噬細(xì)胞作為一群具有可塑性的免疫細(xì)胞，可因不同的環(huán)境刺激分化為功能各異的亞型[8]。根據(jù)不同的細(xì)胞特征和功能，巨噬細(xì)胞通常被分為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞是由LPS和干擾素γ等微生物產(chǎn)物或促炎因子激活的。它們通過產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如IL-1、誘導(dǎo)iNOS和TNF-α等，促進(jìn)持續(xù)的炎癥反應(yīng)并引發(fā)組織損傷[9]。另一方面，M2型巨噬細(xì)胞是由IL-4或IL-13誘導(dǎo)的，通過分泌各種抗炎因子，起到減輕炎癥反應(yīng)和修復(fù)組織的作用[10]。識(shí)別這兩種巨噬細(xì)胞的方式主要依賴于各自的生物標(biāo)記，如M1型（iNOS，CD11c，MARCO）和 M2 型（Arg1、CD68、CD206）[11]。本文中iNOS和CD206分別作為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志。其中，M1型及M2型巨噬細(xì)胞分別執(zhí)行著“破壞”及“修復(fù)”的功能[12]。M1型巨噬細(xì)胞可通過釋放大量的促炎因子引發(fā)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。M2型巨噬細(xì)胞則分泌抗炎因子以減輕過度的炎癥反應(yīng)[13]。因此，通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的極性達(dá)到免疫平衡將成為治療炎癥相關(guān)疾病的有效手段。

姜黃素作為一種相對(duì)安全的植物多酚，具有廣泛的藥理作用，可用于防治心血管疾病、腫瘤、炎癥性腸病、缺血性腦卒中等疾病[14-15]。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，姜黃素具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用[5，16]。有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過增加M2型巨噬細(xì)胞、減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞，從而影響巨噬細(xì)胞功能，減輕炎癥反應(yīng)[17-19]。本研究顯示姜黃素可抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，減少巨噬細(xì)胞中促炎因子（TNF-α及IL-6）的表達(dá)。

本研究通過Western blot方法分別檢測(cè)p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65 的總體水平及磷酸化水平，結(jié)果提示姜黃素可抑制TLR4-MAPK/NF-κB信號(hào)通路的激活，后者被證實(shí)參與調(diào)控M1型細(xì)胞因子（TNF-α及IL-6）的表達(dá)。姜黃素可通過作用于多種分子靶點(diǎn)（包括各種蛋白質(zhì)激酶和轉(zhuǎn)錄因子）調(diào)控細(xì)胞的炎癥及免疫反應(yīng)[20]。TLR4作為一種病原模式識(shí)別受體，在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用[21]。通常情況下，TLR4可被LPS激活，通過調(diào)控下游信號(hào)通路促使巨噬細(xì)胞向M1型極化，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[22]。本研究也提示LPS能顯著激活TLR4及其下游的MAPK以及NF-κB信號(hào)通路。NF-κB作為一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，參與轉(zhuǎn)錄各種與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)的基因。最近的研究證實(shí)，姜黃素可以通過阻斷TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路減輕急性炎癥損傷[23-25]。另一項(xiàng)研究表明，姜黃素可通過抑制TLR4的激活、ERK1/2及p38 MAPK的磷酸化、NF-κB的核移位減少炎癥介質(zhì)的過度表達(dá)。本研究結(jié)果也表明，M1型細(xì)胞因子（TNF-α及 IL-6） 的表達(dá)依賴于TLR4/MAPK信號(hào)通路的激活。

綜上所述，姜黃素可通過抑制TLR4-MAPK/NF-κB信號(hào)通路的激活，從而抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化并減少炎癥因子TNF-α及IL-6的表達(dá)。該結(jié)果將為姜黃素在炎癥相關(guān)疾病防治領(lǐng)域中的應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。