張曉英，董小敏，王飛鵬，張新選

咸陽(yáng)市中心醫(yī)院1婦科，2檢驗(yàn)科，陜西 咸陽(yáng)712000

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤是胚胎的滋養(yǎng)細(xì)胞層發(fā)生惡變而形成的惡性腫瘤，以滋養(yǎng)層細(xì)胞異常增生為特征[1]。蛋白水解酶和細(xì)胞黏附分子在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及細(xì)胞黏附分子的表達(dá)異?；蚬δ苋笔悄[瘤發(fā)生局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要影響因素[2-3]。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是鈣依賴性黏附蛋白家族中的重要成員，是維護(hù)正常上皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性的重要因子，能夠介導(dǎo)同種細(xì)胞的黏附；當(dāng)E-cadherin的表達(dá)水平下降時(shí)，腫瘤細(xì)胞極易發(fā)生脫落，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[4]。基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，具有促進(jìn)血管生成、腫瘤生長(zhǎng)及調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的作用，在腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[5]。本研究通過(guò)檢測(cè)E-cadherin和MMP9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中的表達(dá)水平，分析妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin與MMP9表達(dá)的相關(guān)性及其與患者臨床特征的關(guān)系，旨在為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的診斷與治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年2月至2018年4月咸陽(yáng)市中心醫(yī)院收治的82例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；②術(shù)前未接受過(guò)化療；③無(wú)婦科炎性疾?。虎苡锌晒z測(cè)的腫瘤組織標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并非妊娠性絨毛膜癌；②合并其他部位惡性腫瘤；③合并免疫系統(tǒng)疾??；④合并嚴(yán)重的心、肝、腎功能不全。82例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者的年齡為19～51歲，平均年齡為（34.87±8.62）歲；病理類型：侵蝕性葡萄胎53例，絨毛膜癌29例；手術(shù)類型：全子宮切除術(shù)62例，子宮病灶切除術(shù)20例。收集經(jīng)手術(shù)切除的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織標(biāo)本。另外，選取同期于咸陽(yáng)市中心醫(yī)院行人工流產(chǎn)術(shù)的39例健康女性的正常早孕絨毛組織標(biāo)本作為對(duì)照。39例健康女性的年齡為20～42歲，平均年齡為（35.17±6.72）歲。妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者與健康女性的年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，患者及家屬均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人E-cadherin多克隆即用型抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，稀釋濃度為1∶100；鼠抗人MMP9單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santacruz公司，稀釋濃度為1∶50。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)AMRESCO公司；免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)E-cadherin和MMP9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織和正常早孕絨毛組織中的表達(dá)水平。所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%的福爾馬林溶液固定，采用石蠟包埋進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，將切片置于60～65℃的烘箱中烘烤4 h。采用二甲苯脫蠟，采用梯度乙醇進(jìn)行水化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，每次5 min，高壓修復(fù)抗原，修復(fù)時(shí)間為2 min，取出抗原修復(fù)盒，自然冷卻后，再次使用PBS沖洗3次，應(yīng)用3%的雙氧水滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，從而阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；加入50 μl一抗（兔抗人E-cadherin多克隆即用型抗體），置于濕盒中，4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，然后加入二抗（鼠抗人MMP9單克隆抗體），室溫下靜置20 min，應(yīng)用DAB顯色液染色；自來(lái)水沖洗后應(yīng)用蘇木素復(fù)染，再用自來(lái)水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后應(yīng)用中性樹(shù)膠進(jìn)行封固，光鏡下觀察E-cadherin和MMP9的染色情況。以試劑公司提供的已知陽(yáng)性表達(dá)的石蠟切片作為陽(yáng)性對(duì)照，選取PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

E-cadherin和MMP9的免疫組織化學(xué)陽(yáng)性染色結(jié)果均表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒。所有病理切片均由兩名高年資病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行評(píng)定。依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分[6]。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為0計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比＜15%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為15%～50%計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比＞50%計(jì)3分。將染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分相乘，＞3分為E-cadherin或MMP9表達(dá)為陽(yáng)性，≤3分為E-cadherin或MMP9表達(dá)為陰性。

1.5 觀察指標(biāo)

比較E-cadherin和MMP9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織和正常早孕絨毛組織中的表達(dá)水平，分析妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin、MMP9的表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系，并分析妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin與MMP9表達(dá)的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中E-cadherin和MMP 9陽(yáng)性表達(dá)率的比較

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率為56.10%（46/82），明顯低于正常早孕絨毛組織的97.44%（38/39），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.276，P＜0.01）。妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中MMP9的陽(yáng)性表達(dá)率為93.90%（77/82），明顯高于正常早孕絨毛組織的30.77%（12/39），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=54.155，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin和MMP9陽(yáng)性表達(dá)率的比較

不同年齡、腫瘤直徑、前次妊娠是否存在葡萄胎的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin和MMP9的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、子宮肌層浸潤(rùn)深度≥2/3、有肺轉(zhuǎn)移的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、子宮肌層浸潤(rùn)深度＜2/3、無(wú)肺轉(zhuǎn)移的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.588、12.345、18.049，P＜0.01）。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、子宮肌層浸潤(rùn)深度≥2/3、有肺轉(zhuǎn)移的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中MMP9的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、子宮肌層浸潤(rùn)深度＜2/3、無(wú)肺轉(zhuǎn)移的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.546、12.429、14.392，P＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin和MMP 9的陽(yáng)性表達(dá)情況（n=82）

2.3 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin與MMP9表達(dá)的相關(guān)性

對(duì)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin和MMP9表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，E-cadherin和MMP9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.605，P＜0.01）。

3 討論

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤均來(lái)自胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞，根據(jù)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵蝕能力、有無(wú)絨毛、增生程度及其他生物學(xué)特性，其可分為葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨毛膜癌和胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤[1]，其中，胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤是指來(lái)源于胎盤種植部位的一種特殊類型的滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，葡萄胎僅局限在子宮腔內(nèi)，屬于非惡性妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，而絨毛膜癌和侵蝕性葡萄胎能夠浸潤(rùn)子宮肌層或向其他器官轉(zhuǎn)移，為惡性妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤[7-10]。浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著、最本質(zhì)的生物學(xué)特征，細(xì)胞黏附為惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，而參與細(xì)胞間相互作用的細(xì)胞黏附分子是腫瘤細(xì)胞惡性行為的基礎(chǔ)[11-13]。E-cadherin可通過(guò)影響上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，減少細(xì)胞間質(zhì)中的纖維組織成分，促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)中細(xì)胞骨架成分的降解，從而為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)[14]。E-cadherin對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及形態(tài)改變具有重要的調(diào)節(jié)作用[15]。此外，E-cadherin蛋白和基因表達(dá)水平的變化與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其在多種腫瘤中低表達(dá)或不表達(dá)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常早孕絨毛組織（P＜0.01），臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、浸潤(rùn)子宮肌層深度≥2/3、有肺轉(zhuǎn)移的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中的E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、浸潤(rùn)子宮肌層深度＜2/3、無(wú)肺轉(zhuǎn)移的患者，表明E-cadherin在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率較低，且E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者的某些臨床特征可能有關(guān)，提示E-cadherin能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞分裂，從而促進(jìn)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，影響疾病的發(fā)生與發(fā)展，分析其原因主要是因?yàn)殡S著E-cadherin表達(dá)水平的逐漸降低甚至消失，細(xì)胞間的黏附能力降低甚至缺失，細(xì)胞的黏附與分化受到影響，腫瘤細(xì)胞極易自母體脫離從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族是一組具有相似結(jié)構(gòu)和功能的蛋白水解酶，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，MMP9是MMP家族中的重要成員，其能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的Ⅳ型膠原蛋白，使基底膜的完整性遭到破壞，使腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜屏障，進(jìn)而協(xié)助腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，在腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[18-21]。此外，MMP9還能夠使組織結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑并誘導(dǎo)新生腫瘤血管的形成從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中MMP9的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常早孕絨毛組織（P＜0.01），且TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、子宮肌層浸潤(rùn)深度≥2/3、有肺轉(zhuǎn)移的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中MMP9的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯無(wú)肺轉(zhuǎn)移的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者（P＜0.01），說(shuō)明MMP9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率較高，且參與了妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，可作為評(píng)估妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤惡性程度的有效指標(biāo)之一。本研究還對(duì)E-cadherin和MMP9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，E-cadherin和MMP9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.605，P＜0.01），提示兩者可能存在拮抗作用，并協(xié)同參與了妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。分析其原因可能是因?yàn)镸MP9能夠通過(guò)下調(diào)E-cadherin的表達(dá)從而誘發(fā)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)展。

綜上所述，妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中E-cadherin的表達(dá)明顯下調(diào)，MMP9的表達(dá)明顯上調(diào)，且其陽(yáng)性表達(dá)情況可能與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者的TNM分期、子宮肌層浸潤(rùn)深度和肺轉(zhuǎn)移情況關(guān)系密切。因此，檢測(cè)E-cadherin與MMP9有助于評(píng)估惡性妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的惡性程度。后續(xù)相關(guān)研究可以探討E-cadherin、MMP9表達(dá)與惡性妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者生存預(yù)后的關(guān)系。