曹文娟 羅政強 徐飛 鄭澤航 吳驍偉

平板振動療法是近年來臨床上廣泛應(yīng)用的一種治療方式，振動療法的治療效果與振動頻率、振動幅度及振動時間相關(guān)。低頻振動是指頻率低于100 Hz的振動，低頻振動對于肌肉萎縮性疾病有一定的療效［1］，其產(chǎn)生作用的機(jī)制主要為振動作用通過力學(xué)信號系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生作用。在骨骼系統(tǒng)中，力學(xué)信號同樣有重要作用。機(jī)械應(yīng)力信號能通過細(xì)胞表面的感受器轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號發(fā)揮作用［2］。低頻振動對骨骼系統(tǒng)產(chǎn)生作用是現(xiàn)階段的研究熱點之一［3］。振動可以增加人體的平衡感，增強肌力；同時，振動被認(rèn)為可以促進(jìn)成骨細(xì)胞活性，抵消衰老對骨質(zhì)的影響，防止骨質(zhì)流失［4］?，F(xiàn)階段有較多振動對骨骼系統(tǒng)影響的研究，但結(jié)果并不一致，其原因可能為各研究的振動頻率和幅度不同［5-9］。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是骨骼系統(tǒng)中骨形成的主要來源細(xì)胞，其不僅可分化為成骨細(xì)胞而且能分泌相關(guān)細(xì)胞因子影響破骨細(xì)胞的形成與分化［10］。本研究采用低頻振動干預(yù)BMSCs 向成骨分化的進(jìn)程，并檢測相關(guān)分泌因子，以明確低頻振動對BMSCs 成骨分化的影響。

材料與方法

一、分離、培養(yǎng)及鑒定小鼠BMSCs

取3 周齡C57BL/6 小鼠（由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物實驗遵守我院倫理委員會相關(guān)規(guī)定），麻醉后采用頸椎脫臼法處理小鼠。收集小鼠的雙側(cè)股骨與雙側(cè)脛骨，注射器沖洗取其內(nèi)的BMSCs，采用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為a-MEM（Hyclone 公司，美國）［10%胎牛血清（fetal calf serum, FCS；Gibico 公司，美國）+1%抗生素］。72 h進(jìn)行換液，以后每3 d進(jìn)行換液，細(xì)胞長到90%進(jìn)行傳代。培養(yǎng)的第3代細(xì)胞分別進(jìn)行誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化、脂肪細(xì)胞分化及軟骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化結(jié)束進(jìn)行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色，油紅O 染色及阿利新藍(lán)染色（Sigma 公司，美國），并采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)測定其細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志物。

二、體外低頻振動干預(yù)小鼠BMSCs的成骨分化

取第3 代BMSCs 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為a-MEM含10%FCS，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，0.1 μmol/L 地塞米松，50 mg/L 維生素C。在誘導(dǎo)過程中采用平板振動臺（Juvent Health 公司，美國）進(jìn)行低頻振動（15 Hz，垂直加速度0.3 g）干預(yù)，干預(yù)方式為每天一次，一次45 min，于干預(yù)第7天及第14天收獲細(xì)胞。對照組細(xì)胞，每天只將細(xì)胞放置在平板振動臺上45 min，但不進(jìn)行振動干預(yù)，同樣于第7天及第14天收獲細(xì)胞。

三、ALP染色及茜素紅染色

將收獲的第7天細(xì)胞進(jìn)行ALP染色，步驟如下：采用10%甲醛固定1 min，然后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，加入BCIP染色液，避光環(huán)境下染色15 min。自來水下沖洗，保持稍濕潤。將收獲的第14天的細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，染色步驟如下：吸去培養(yǎng)基，PBS小心漂洗3次，4%的多聚甲醛固定30 min；吸去固定液，去離子水漂洗3 次，加入茜素紅染色液（pH 4.1～4.3），常溫下避光孵育45 min；小心吸去染色液，去離子水漂洗細(xì)胞至少4 次；最后一次加入PBS 保持細(xì)胞濕潤。

四、Real-time PCR分析

干預(yù)14 天后收獲細(xì)胞，每107個細(xì)胞加入1 ml Trizol 進(jìn)行裂解，沖打后冰上靜置5 min，將Trizol 移至1.5 ml EP 管，加入0.2 ml 三氯甲烷，孵育3 min，4 ℃、1 200×g 離心15 min，將上層清液轉(zhuǎn)移到一個新的EP 管中，并加入0.5 ml 異丙醇，4 ℃、1 200×g離心10 min，EP管底部即為RNA，棄上清，再用75%乙醇洗滌所提RNA 一次，并調(diào)整兩組總RNA 濃度一致，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR 檢測：Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ,ColⅠ），骨橋蛋白（osteopontin,OPN），骨鈣素（osteocalcin，OCN），骨保護(hù)素（osteoprotegerin, OPG）和破骨細(xì)胞分化因子（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）等基因的表達(dá)（內(nèi)參選用18S）。所用引物序列如表1所示。

五、培養(yǎng)上清酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）分析

在誘導(dǎo)分化的第12 天將成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的FCS含量更換為0.5%，培養(yǎng)48 h后，換為無血清成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，24 h 后收集上清液。按照ELISA 試驗盒（USCN）操作指南測定培養(yǎng)上清液中OPG 及RANKL的含量。

表1 Real-time PCR所用引物序列

六、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.1統(tǒng)計軟件（IBM公司，美國）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、BMSCs的鑒定

將培養(yǎng)的第3 代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，成骨誘導(dǎo)7 d進(jìn)行ALP染色，成脂誘導(dǎo)7 d進(jìn)行油紅O染色，成軟骨誘導(dǎo)14 d進(jìn)行阿利新藍(lán)染色。三系分化均為陽性（圖1），所分離細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的多項分化潛能；流式細(xì)胞學(xué)檢測，顯示其表面標(biāo)志物Scal-1（+）、CD29（+）、CD11b（-）、CD45（-）（圖2）。

二、低頻振動促進(jìn)BMSCs成骨分化

通過低頻振動刺激7 d，兩組細(xì)胞均進(jìn)行ALP染色。低頻振動組ALP 活性明顯高于對照組。刺激14 d 后，低頻振動組鈣節(jié)結(jié)形成量明顯多于對照組（圖3），說明低頻振動對BMSCs 向成骨分化起促進(jìn)作用。

三、低頻振動能改變成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)

圖1 三系分化染色均為陽性（×4） a：ALP染色；b：油紅O染色；c：阿利新藍(lán)染色

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測示表面標(biāo)志物 a：對照組；b～e：Scal-1（+）、CD29（+）、CD11b（-）、CD45（-）

低頻振動干預(yù)14 d后收獲細(xì)胞提取RNA，逆轉(zhuǎn)Real-time PCR 檢測了Col Ⅰ、OPN、OPG、RANKL、OCN等相關(guān)基因的表達(dá)。與對照組相比，低頻振動組Col Ⅰ、OPN、OCN、OPG基因表達(dá)增加，RANKL基因表達(dá)下降（圖4）。且細(xì)胞培養(yǎng)上清中，低頻振動組OPG 含量為（55.9±2.8）μg/L，較對照組的（30.5±1.8）μg/L 增高，RANKL 含量（3.5±0.1）μg/L，較對照組的（5.2±0.2）μg/L 下降，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，如圖5）。RANKL 能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成，而OPG 通過競爭性抑制RANKL 的作用來抑制破骨細(xì)胞分化。這表明低頻振動能提高BMSCs 的成骨能力，且能通過分泌OPG、RANKL 等蛋白來參與對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控。

圖3 細(xì)胞染色（大體觀） a：對照組ALP染色；b：低頻振蕩組ALP染色；c：對照組茜素紅染色；d：低頻振蕩組茜素紅染色

圖4 Col Ⅰ、OPN、OCN、OPG及RANKL基因表達(dá)（以18S作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理） 與對照組相比，*P＜0.05

圖5 兩組培養(yǎng)基上清液中OPG 及RANKL 含量 與對照組相比，*P＜0.05

討 論

BMSCs 是存在于骨髓腔內(nèi)的主要細(xì)胞之一，在不同的條件下可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞與軟骨細(xì)胞等，具有一定的干細(xì)胞特性。本研究中通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取了小鼠的BMSCs，在體外成功地誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞；同時，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了其表面抗原標(biāo)志物，結(jié)果顯示Scal-1（+）、CD29（+）、CD11b（-）、CD45（-），與相關(guān)研究表達(dá)一致［11，12］。BMSCs 向成骨分化的過程中，有多種因素可影響其分化結(jié)果，比如細(xì)胞因子、磁場與力學(xué)刺激等［13-15］。

生物機(jī)械應(yīng)力及力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在細(xì)胞分化方向調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。BMSCs 表面存在力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)蛋白，能將力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮相關(guān)作用。細(xì)胞膜上的整合素、G 蛋白和離子通道等感受到外界應(yīng)力后，通過細(xì)胞骨架及相關(guān)信號通路將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，作用于細(xì)胞核［16］，其中重要的一條細(xì)胞信號通路為MAPKs 通路［17］。過度應(yīng)力可激活p38 及ERK 破壞軟骨基質(zhì)，介導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡?；罨募っ鸽S后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，通過活化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而將力學(xué)信號刺激從細(xì)胞外傳至細(xì)胞核，并介導(dǎo)產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo proteinases, MMPs）在內(nèi)的多種炎癥因子［18，19］。同時，外界應(yīng)力刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)后可磷酸化I-κB，導(dǎo)致I-κB被降解、I-κB與NF-κB解聚、NF-κB被激活并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，以p65/p50異二聚體的形式結(jié)合至DNA 上的相應(yīng)位點，調(diào)控下游含有NFκB結(jié)合序列的靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而影響細(xì)胞的功能［20］。

低頻振動作為力學(xué)刺激的一種，在醫(yī)療上應(yīng)用廣泛。低頻振動在康復(fù)方面對肌萎縮有較好的療效，其機(jī)制為刺激肌肉過量表達(dá)IGF-I、MyoD，Myostatin 的表達(dá)減少，通過推動骨骼肌蛋白合成、抑制骨骼肌蛋白分解，從而推動骨骼肌萎縮的恢復(fù)［21］。低頻振動作用于BMSCs后，在誘導(dǎo)其向成骨分化過程中，ALP活性增高，且鈣結(jié)節(jié)數(shù)目增加，OCN、OPG表達(dá)增加，RANKL表達(dá)下降。ALP是評價成骨細(xì)胞分化過程中早期標(biāo)志之一，鈣結(jié)節(jié)是評價成骨細(xì)胞功能的晚期指標(biāo)，形成鈣結(jié)節(jié)的多少與成骨細(xì)胞功能呈正相關(guān)。RANKL 是單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中的一種重要蛋白，OPG是RANKL的一種競爭性抑制劑［22］。本研究結(jié)果表明，低頻振動對骨代謝起正性調(diào)節(jié)作用，一方面可促進(jìn)骨生成，另一方面可通過成骨細(xì)胞分泌的相關(guān)蛋白來抑制破骨細(xì)胞的生成。

本研究亦存在相關(guān)不足，低頻振動是如何促進(jìn)成骨生成的，并沒有深入研究，其機(jī)制如何，是否有NF-κB、MAPKs 通路的參與暫不得而知。我們計劃下一步繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究。對于低頻振動的頻率，我們僅采用了一種頻率，因為我們預(yù)試驗顯示此頻率有較好的誘導(dǎo)成骨效果。

綜上所述，低頻振動有較好的誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨作用，且能通過成骨細(xì)胞分泌相關(guān)蛋白抑制破骨細(xì)胞的生成。同時，低頻振動具有無創(chuàng)傷、副作用小的優(yōu)點，在應(yīng)用上前景廣泛，臨床使用價值高。