趙霞 閆善信 瓦房店市疾病預(yù)防控制中心 （遼寧 大連 116300）

內(nèi)容提要： 目的：查究氣相色譜法分析不同萃取方法對(duì)魚(yú)油中EPA、DHA含量的影響。方法：利用超聲強(qiáng)化亞臨界水、酶解法、超臨界CO2萃取、超聲輔助溶劑等方法從黃鮫魚(yú)胃部萃取魚(yú)油，并利用氣相色譜法進(jìn)行分析，以比較四種萃取方法萃取的魚(yú)油中的EPA、DHA含量。結(jié)果：不同萃取方法嚴(yán)重影響魚(yú)油中EPA與DHA的含量，且各萃取方法中EPA與DHA的含量的差異性極為明顯，在統(tǒng)計(jì)學(xué)方面存在意義（P＜0.01）。結(jié)論：不同的萃取方法會(huì)對(duì)魚(yú)油中的EPA、DHA含量產(chǎn)生較大影響。

魚(yú)油中存在豐富的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸，以脂肪酸二十碳五烯酸（EPA）與二十二碳六烯酸（DHA）為主要成分[1]，有“腦黃金”的譽(yù)名。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料。選擇黃鮫魚(yú)魚(yú)胃；分析純則選擇天津科密歐化學(xué)試劑有限公司提供的異辛烷、氫氧化鉀、硫酸氫鈉、甲醇、無(wú)水硫酸鈉；Sigma公司提供的純度超過(guò)99%的EPA甲酯與DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品。

1.1.2 儀器。島津國(guó)際貿(mào)易有限公司提供的型號(hào)為Rtx-5的氣相色譜柱、色譜儀（30m×25mm）；杭州華黎泵業(yè)有限公司提供的型號(hào)為HA220-50-06的超臨界CO2萃取設(shè)備；常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司生產(chǎn)的型號(hào)為L(zhǎng)T3002E的電子天平；上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)的型號(hào)為SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵與型號(hào)為RE-52的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；型號(hào)為PS-10A的潔康牌超聲波；上海驚宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為DHG-9076A的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；而超聲強(qiáng)化亞臨界水設(shè)備則是由實(shí)驗(yàn)室自制的。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚(yú)油提煉。清洗黃鮫魚(yú)魚(yú)胃，清除雜質(zhì)，并從中提煉魚(yú)油，將黃鮫魚(yú)魚(yú)胃切割成尺寸1cm大小的原料樣品，將其放置在-60°C的冷阱環(huán)境中，針孔壓力設(shè)置為0.1Pa，在冷凍干燥24h后，將樣品放置在密封盒中以冷藏備用。通過(guò)超聲波輔助溶劑、超臨界CO2法、超聲強(qiáng)化亞臨界水、中性蛋白酶水解等多種方法從黃鮫魚(yú)魚(yú)胃中提煉黃油，嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行操作，嚴(yán)格掌控魚(yú)油的萃取時(shí)間與萃取溫度，各儀器設(shè)備的萃取參數(shù)如下：超聲波輔助溶劑：500W、20kHz、25°C、30min（正乙烷提?。?；超臨界CO2萃取設(shè)備：65°C、30MPa、5h、設(shè)置3mL/min的流體速度；超聲強(qiáng)化亞臨界水設(shè)備：250W、20kHz、5022kPa、60min；酶解：選用中性蛋白酶，劑量為1%（W/W），30°C振蕩5h進(jìn)行提取。

1.2.2 脂肪酸甲酯提煉。嚴(yán)格按照GB/T173-76-2008的國(guó)標(biāo)提煉脂肪酸甲酯。

1.2.3 分析條件。選用型號(hào)為Rtx-5的色譜柱，30m×0.25mm，F(xiàn)ID檢測(cè)器的溫度設(shè)置為320°C，進(jìn)樣器的溫度設(shè)置為300°C，空氣流量控制在300mL/min左右，而燃燒氣（氫氣）的流量控制在30mL/min左右，進(jìn)樣量設(shè)置是1μL，其載氣為氮?dú)狻Ｕ{(diào)整升溫程序中的分流比與溫度等相關(guān)參數(shù)，以求能夠準(zhǔn)確測(cè)量樣品中的EPA與DHA含量。

1.2.4 計(jì)算目標(biāo)峰以及與其相鄰峰的分離度。分離度又名為分辨率，是指目標(biāo)峰和與它相鄰峰之間的分離程度，通常表示為R。R值越高，就說(shuō)明相鄰的兩峰間的分離程度越好。在R不超過(guò)1時(shí)，表示相鄰的兩峰之間存在重疊情況；在R等于1時(shí)，表示相鄰的兩峰之間已基本完成分離；在R等于1.5時(shí)，表示相鄰的兩峰之間不存在任何聯(lián)系，已分離徹底。R值是指相鄰兩色譜峰之間的保留時(shí)間差/相鄰兩色譜峰的峰寬均值，利用公式可表示如下：

公式（1）中的符號(hào)代表意義如下：tR1是指相鄰兩峰的前峰所對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間；tR2是指相鄰兩峰的后峰所對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間；W1、W2指的是相鄰兩峰之間存在的峰寬。

1.2.5 萃取方法的不同影響的EPA與DHA含量。EPA與DHA通過(guò)異辛烷進(jìn)行稀釋?zhuān)杂糜贕C分析，對(duì)分離最大值時(shí)的升溫程序進(jìn)行分析，以色譜分析結(jié)果為基礎(chǔ)，明確EPA與DHA保留時(shí)間，并根據(jù)樣品中的EPA與DHA濃度和色譜峰面積得出標(biāo)準(zhǔn)方程，公式如下：

公式（2）中的C是指魚(yú)油樣品中的EPA與DHA濃度；V溶劑是指溶劑體積；C0是指標(biāo)準(zhǔn)的EPA與DHA濃度；Ax是指EPA與DHA的色譜峰面積；A0是指標(biāo)準(zhǔn)的EPA與DHA色色譜峰面積；Mx是指樣品質(zhì)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)資料均輸入Excel中分析誤差，并通過(guò)鄧肯多比較法分析顯著性差異。

2.結(jié)果

2.1 本次探究活動(dòng)中所涉及到的數(shù)據(jù)資料均為平均值

在Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析過(guò)程中，均得出P值、F值等數(shù)據(jù)，由此可知：不同萃取方法嚴(yán)重影響魚(yú)油中EPA與DHA的含量，且各萃取方法中EPA與DHA的含量的差異性極為明顯，在統(tǒng)計(jì)學(xué)方面存在意義（P＜0.01）。詳情見(jiàn)表1。

從表1與圖1中可以看出：在魚(yú)油提煉中，超聲強(qiáng)化亞臨界水的效率最高，為13.97%，尤其是EPA與DHA的萃取率遠(yuǎn)高于其他萃取方法，分別是54.67mg/g與134.01mg/g。

表1. 萃取方法的不同對(duì)魚(yú)油萃取率、EPA與DHA含量的影響

3.討論

本次脂肪酸甲酯化使用國(guó)標(biāo)GB/T173-76-2008，能夠有效保證甲酯化的程度，保證魚(yú)油樣品中EPA與DHA的含量測(cè)定的準(zhǔn)確性，從而保證各萃取方法中EPA與DHA的含量測(cè)定的精確性[2]。

本研究中，超聲強(qiáng)化亞臨界水的魚(yú)油萃取率較高，相應(yīng)的其EPA與DHA的含量也是最高的，其次是酶解法，最后是超臨界CO2萃取法與超聲輔助溶劑方法，差異性顯著，在統(tǒng)計(jì)學(xué)方面有意義（P＜0.01）。和現(xiàn)有的張郢峰等人的研究結(jié)果差異不大。

綜上所述，我國(guó)市場(chǎng)中所售賣(mài)的魚(yú)油商品均是經(jīng)過(guò)甲酯化處理的，因此甲酯化后測(cè)定魚(yú)油中的EPA與DHA的含量的結(jié)果精確度更高，且EPA與DHA的含量受到魚(yú)油萃取方法的影響。

圖1. 各萃取方法的魚(yú)油萃取氣相色譜圖