郁大偉 宋華峰 邱文娜 薛婧 酈芳華 胥萍

據(jù)WHO統(tǒng)計，新發(fā)結(jié)核病患者中，有10.2%的患者會出現(xiàn)對至少一種抗結(jié)核藥物耐藥[1]。中國每年新增耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者約12萬例，其傳染性更強、治愈率更低，病死率更高，因此，如何更早、更高效地發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者、尤其是MDR-TB患者，成為了控制耐藥結(jié)核病傳播的關(guān)鍵[2]。目前，臨床上常用的一線抗結(jié)核藥品為異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素，與其他抗結(jié)核藥品相比，利福平單耐藥的發(fā)生率較低，可把利福平耐藥作為診斷MDR-TB的指征[3]。目前檢測耐藥結(jié)核病的方法中，傳統(tǒng)的BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960”)及改良羅氏藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結(jié)果雖準確可靠，但檢測周期長，易造成診斷延誤。亟需尋求能夠快速、準確、安全的檢測結(jié)核分枝桿菌(MTB)及其耐藥性的分子診斷技術(shù)。筆者對GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)檢測痰標本中MTB及其耐藥性的效能進行分析與探討。

資料和方法

1.研究材料：收集2018年1—12月蘇州市第五人民醫(yī)院收治的疑似肺結(jié)核患者的痰標本414份。痰標本由患者按要求自行采集，留痰前先用清水漱口，從肺部深處用力咳出痰液，收集于一次性無菌痰瓶之中，痰液量約3～5 ml。分別采用GeneXpert和MGIT 960技術(shù)進行檢測。

2.儀器與試劑：GeneXpert試劑盒(美國Cepheid公司)，GeneXpert檢測系統(tǒng)(美國Cepheid公司)；MGIT 960培養(yǎng)管(美國BD公司)，MTB快速培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD公司)，分枝桿菌羅氏培養(yǎng)管(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

3.痰涂片抗酸染色：采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的抗酸染色液試劑盒，按照《結(jié)核病實驗室標準化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[4]中的檢測要求和操作步驟進行檢測。

4.MTB培養(yǎng)及藥敏試驗：將痰瓶中痰液轉(zhuǎn)移1～2 ml至50 ml離心管中，加入等體積的4%氫氧化納(NaOH)進行充分液化，漩渦振蕩、混勻，靜置30 min，加入40 ml pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)中和、離心，棄上清。在棄去上清的離心管中加入0.5 ml生理鹽水，吹打、混勻。吸取 0.5 ml標本加入MGIT 960培養(yǎng)管中，將接種好的培養(yǎng)管放入儀器中進行培養(yǎng)。MGIT 960培養(yǎng)報陽后，挑取生長良好的菌落，與磨菌管底部的PBS緩沖液混合均勻，配備不同濃度的菌懸液。用接種環(huán)沾取1滿環(huán)約為0.01 ml不同稀釋倍數(shù)的菌懸液，用劃線法均勻涂布于各培養(yǎng)基表面。37 ℃培養(yǎng)，至4周報告結(jié)果。若藥敏試驗培養(yǎng)管上有菌落生長則在4周內(nèi)可報告結(jié)果；若4周內(nèi)對照培養(yǎng)管上長滿菌落而藥敏試驗培養(yǎng)管內(nèi)無細菌生長，不能輕易報告“敏感”，因耐藥菌常較敏感菌生長緩慢，故需延長培養(yǎng)約1～2周，再觀察結(jié)果。

5.GeneXpert檢測：痰液標本加入2倍樣本體積的樣本處理液進行液化，擰緊瓶蓋，漩渦振蕩至少20 s，將混勻后的樣本于室溫下靜置15 min；用無菌移液管吸取液化的樣品，直至彎月面在移液管的最低標記之上(注意避免形成氣溶膠)，由檢測匣的加樣孔緩慢加入，蓋上檢測匣蓋子，上機檢測。

6.統(tǒng)計學處理：應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以“率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。以痰培養(yǎng)藥敏試驗結(jié)果為參照，計算GeneXpert的檢測效能指標，各項指標計算方法：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；符合率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總檢測人數(shù)×100%。一致性檢驗采用Kappa檢驗，即：Kappa值≥0.75為一致性較好；0.40≤Kappa值<0.75為一致性一般；Kappa值<0.40為一致性較差。

結(jié) 果

1.痰標本陽性檢出情況：通過檢測414份痰標本，痰涂片陽性檢出率為18.6%(77/414)，MGIT 960培養(yǎng)的陽性檢出率為31.4%(130/414)，GeneXpert檢測的陽性檢出率為35.3%(146/414)。GeneXpert和MGIT 960培養(yǎng)的陽性檢出率明顯高于痰涂片(χ2=29.22，18.09，P值均<0.001)，而GeneXpert的陽性檢出率與MGIT 960培養(yǎng)相比，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.39，P=0.238)。

表1 GeneXpert檢測以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為參照檢測MTB利福平耐藥的效能分析

2.耐藥檢測情況：GeneXpert檢出的146份陽性標本中利福平耐藥檢出率為9.6%(14/146)，MGIT 960培養(yǎng)陽性的130份痰標本中利福平耐藥檢出率為9.2%(12/130)，兩者之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.01，P=0.919)。

3.耐藥檢測效能評價：99份痰標本同時具有GeneXpert檢測和MGIT 960培養(yǎng)的藥敏結(jié)果，以MGIT 960培養(yǎng)藥敏結(jié)果為參照，GeneXpert檢測MTB利福平耐藥的敏感度為81.8%、特異度為98.9%、符合率為97.0%、Kappa值為0.84，見表1。

討 論

隨著分子生物學診斷技術(shù)的迅猛發(fā)展，PCR 等核酸擴增技術(shù)在臨床檢驗中起著越來越關(guān)鍵的作用，這類檢測方法具有速度快、敏感度高、效率高等優(yōu)點，尤其對于結(jié)核病的早期診斷具有獨特優(yōu)勢。但傳統(tǒng)的PCR操作過程較復雜、易出現(xiàn)交叉污染，而出現(xiàn)假陽性的情況，容易使臨床對患者的病情出現(xiàn)誤診[5]。此外，PCR 檢測對設(shè)備的要求高，對操作人員要求也比較高，需經(jīng)過PCR檢測技術(shù)的崗前培訓。因此，將其在大多數(shù)基層醫(yī)院普及還需要一個過程。目前，隨著科技的不斷進步，檢測設(shè)備及手段同步得到發(fā)展，GeneXpert檢測在全球的開展及接受程度相當廣泛和快速，是唯一受到WHO推薦的，用于MTB及利福平耐藥快速檢測的手段。該方法不易產(chǎn)生氣溶膠、不易污染、可檢測多種類型的樣本、報告周期短、敏感度高、特異度強，一般實驗室條件均可滿足其要求[6-7]。

本研究結(jié)果顯示，與痰涂片結(jié)果相比，GeneXpert檢測和MGIT 960培養(yǎng)陽性檢出率明顯升高，但兩者之間沒有差異。進一步分析耐藥檢測發(fā)現(xiàn)，GeneXpert檢測和MGIT 960培養(yǎng)對MTB利福平耐藥檢出率也沒有差異，與文獻報道結(jié)果一致[8-9]。以MGIT 960培養(yǎng)藥敏檢測結(jié)果為參照，GeneXpert檢測MTB利福平耐藥的敏感度和特異度均較高，分別為81.8%和98.9%，且具有較好的一致性，與文獻報道一致[10-12]。

綜上，本研究結(jié)果表明，GeneXpert在快速檢測MTB及利福平耐藥方面具有較好的效能。值得注意的是，由于該技術(shù)的檢測原理是基因擴增技術(shù)，擴增的模板是核酸，因此其檢測結(jié)果不能區(qū)分死菌和活菌。所以，在臨床檢測中會存在GeneXpert檢測陽性而培養(yǎng)陰性的相互矛盾結(jié)果?？傮w而言，GeneXpert在早期篩查MTB及利福平耐藥時具有較好的效能，且檢測時間快，是一種快速、可靠的輔助診斷方法。