杜楠楠 汪引芳 張鵬

[摘要] 長久以來，心血管疾病威脅著人類的生命健康，而心肌梗死是致死率最高的疾病之一，心肌梗死后心肌損傷、凋亡很大程度上影響著患者的生活質(zhì)量。心肌細胞再生是解決該問題的關(guān)鍵。本文圍繞心肌細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的生理特性，闡述了骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞定向分化中相關(guān)的信號通路及分子機制，總結(jié)了中藥在誘導分化中的調(diào)控機制和作用特點，以期為中藥防治心血管疾病提供參考。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細胞;心肌細胞;中藥;誘導分化

[中圖分類號] R285? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（b）-0030-04

[Abstract] For a long time， cardiovascular diseases have threatened human life and health， and myocardial infarction is one of the most lethal diseases. Myocardial injury and apoptosis after myocardial infarction largely affect the quality of life of patients. Cardiomyocyte regeneration is the key to solve this problem. Based on the physiological characteristics of cardiomyocytes and bone marrow mesenchymal stem cells， this paper elaborates the signaling pathways and molecular mechanisms related to the directional differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocytes， and summarizes the regulatory mechanism and functional characteristics of traditional Chinese medicine in inducing differentiation， in order to provide reference for the prevention and treatment of cardiovascular diseases by traditional Chinese medicine.

[Key words] Bone mesenchymal stem cells; Myocardial cells; Chinese medicine; Induced differentiation

近年來，隨著人們生活方式的改變，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年上升，但至今缺乏有效的預防措施及治療手段。由于心肌細胞（myocardial cells，CM）為終末分化細胞，具有不可再生性，現(xiàn)有療法并不能從根本上解決壞死心肌修復的問題。干細胞是一類具有長期增殖、自我更新和分化潛能的細胞，為細胞生物工程治療相關(guān)疾病提供了新的思路。目前，干細胞移植成為治療多種心血管疾病的替代療法[1-2]。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）是干細胞家族的重要成員，MSC最初在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，稱為骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）。因其具備多向分化潛能、支持造血和促進干細胞植入、免疫調(diào)控和自我復制等特點而日益受到人們的關(guān)注。

1 BMSCs和CM的生物學特性

BMSCs是具有多向分化潛能的成體干細胞，即使連續(xù)培養(yǎng)，也不會喪失其正常的核型及端粒酶活性。因其取材方便、擴增能力強、易于體外培養(yǎng)等優(yōu)點，成為治療心臟疾患的重要選擇。CM又稱心肌纖維，具有興奮收縮的能力。根據(jù)它們的組織學特點和功能差異，粗略地將其分為兩大類型，一類是普通的CM，執(zhí)行收縮功能;另一類是特殊分化的CM，組成心臟的傳導系統(tǒng)。BMSCs在一定條件下能誘導分化為CM及其他一些組織細胞?，F(xiàn)代醫(yī)學對BMSCs誘導分化為CM進行了大量研究并取得了一定的進展，較常用的誘導劑為5-氮胞苷（5-aza）[3-5]、堿性成纖維細胞生長因子[6-7]及催產(chǎn)素等[8]，但實際應用卻因誘導分化水平低、移植后存活率低、細胞毒性大等因素受到限制。

2 BMSC向CM誘導分化的相關(guān)信號通路

在BMSCs向CM誘導分化的過程中，一些信號通路發(fā)揮著重要的作用。①骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路。心臟發(fā)育過程中，BMP信號通路起著非常關(guān)鍵的作用，其能夠促進細胞擴散、遷移和旁分泌，保護細胞在缺氧條件下存活。既往研究[9]發(fā)現(xiàn)，BMSCs經(jīng)BMP-2誘導4周后，分化的心肌細胞存活數(shù)量明顯增多。亦有研究[10]表明，BMSCs經(jīng)BMP-2誘導可向類心肌細胞分化，對急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）再灌注損傷有一定治療作用。②Wnt信號通路。Wnt信號通路是干細胞自我更新，分化和發(fā)育的重要信號通路。在小鼠BMSCs中過表達miR1-2可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路中的Wnt11、JNK、β-catenin和TCF的表達，促進Nkx2.5、cTnI、GATA4等心臟特異性基因表達，誘導BMSCs向CM分化[11]。5-aza誘導大鼠BMSCs中心肌特異性蛋白心肌肌鈣蛋白（cTnT）表達的同時，瞬時受體通道超家族的成員VR1（vanilloid receptor 1）的表達也增高，這些反應與5-aza上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)[12]。③成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）信號通路。研究[6]表明，堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和氫化可的松聯(lián)合應用可刺激人胸骨BMSCs向CM分化，且誘導效率高于5-aza。FGF2還可協(xié)同5-aza誘導BMSCs向CM分化，表現(xiàn)為細胞中Mef2A、Mef2D和基因轉(zhuǎn)錄增加，細胞質(zhì)中游離Ca2+濃度升高，促進早期CM前體的形成，為心肌成形術(shù)提供了可能[13]。④Notch信號通路。Notch信號通路是胚胎發(fā)生和維持細胞穩(wěn)態(tài)的普遍調(diào)控因子。Jagged1為Notch1配體，有報道[14]稱，外源性的Jagged1激活Notch1信號通路，促進BMSCs的多譜系分化，推動了向心臟譜系分化的趨勢。采用5-aza體外誘導hBMSCs向CM分化，Notch1、GATA結(jié)合蛋白-4和Nkx2.5表達上調(diào)，提示Notch1信號通路的過表達可能是hBMSCs向CM分化的潛在機制[15]。還有報道[16]在用5-aza體外誘導豬BMSCs向CM分化的過程中，發(fā)現(xiàn)Notch4表達下調(diào)。

3 中藥單體以及單體間聯(lián)合應用誘導BMSCs向CM分化研究

現(xiàn)代藥理學研究[17]表明，有些中藥具有預防心肌缺血再灌注損傷和改善心肌缺血的作用。隨著中藥提純技術(shù)的提高以及血清藥理學的不斷發(fā)展，某些單味中藥或中藥提取物能有效誘導干細胞定向分化為CM，且無明顯毒副作用，這為應用中醫(yī)藥作為CM誘導劑奠定了堅實的基礎(chǔ)[18]。

3.1 丹參（Salvia）

丹參主要化學成分包括以丹酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）為代表的水溶性酚酸類化合物和以丹參酮ⅡA（tanshinone type ⅡA，Tan ⅡA）為代表的脂溶性菲醌類化合物[19]。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是干細胞分化為CM的關(guān)鍵信號因子，TGF-β1和Sal B體外聯(lián)合運用，可顯著促進BMSCs中GATA4和NKx2.5的轉(zhuǎn)錄表達，促進BMSCs向CM分化[20]。而Sal-B與BMP-2聯(lián)合應用也能顯著促進BMSCs中心肌特異性標志物的表達，提示BMP-2聯(lián)合Sal-B促進了BMSCs的心肌分化[21]。而在體大鼠心肌梗死模型中，在心肌梗死區(qū)周圍進行多點MSC移植并與丹紅注射液聯(lián)合用藥，可促進CXC趨化因子受體4（CXCR4）在MSC中的表達，提高心肌基質(zhì)細胞衍生因子-1的表達，并可抑制AMD3100（SDF1/CXCR4拮抗劑）的抑制作用，提示丹紅注射液通過調(diào)節(jié)SDF1/CXCR4信號通路，提高了CM中MSCs的存活數(shù)量[22]。

3.2 黃芪及黃芪甲苷（AST）

黃芪顆粒能顯著增加AMI大鼠骨髓中CD54、CD106、CD105、CD117陽性細胞百分數(shù)，并增加血液及骨髓中干細胞因子（SCF）的表達水平，表明黃芪能有效動員BMSCs[23]。體外實驗[24]發(fā)現(xiàn)，AST和Tan ⅡA兩者聯(lián)合誘導的BMSCs均可見cTnT、Cx43陽性表達，提示二者聯(lián)合可以誘導BMSCs向CM分化，且聯(lián)合作用高于單一成分。而AST聯(lián)合5-aza誘導MSCs向心肌樣細胞分化，其誘導分化效率顯著高于5-aza單獨用藥。表現(xiàn)為MSCs高效表達cTnT、特異性蛋白結(jié)蛋白Desmin及Cx-43，而且誘導后細胞與正常CM不僅形似，反應心臟功能的心鈉素（ANP）和環(huán)磷酸腺苷（cAMP）mRNA表達水平也顯著升高[25]。

3.3 人參皂苷（GS）

人參皂苷Rh2能劑量依賴性促進BMSCs增殖，可能通過增加DNA合成和促進有絲分裂的機制增強催產(chǎn)素誘導BMSCs向CM分化[26]。汪朝暉等[27]采用GS誘導大鼠BMSCs，結(jié)果顯示誘導后的CM中心肌Desmin、cTnT和肌球蛋白重鏈（MHC）表達均為陽性，且陽性細胞呈梭形和成纖維細胞樣形態(tài)，提示GS在體外能誘導BMSCs分化成心肌樣細胞。有研究[28]表明，預先給予人參皂苷Rh3注射可對大鼠心肌缺血再灌注心肌損傷起到很好的保護作用，這也可能與其能夠減少心肌細胞中氧自由基、上調(diào)心肌細胞抗凋亡蛋白Bcl-2以及抑制促凋亡蛋白Bax表達有關(guān)。

3.4 三七皂苷

既往研究[29]發(fā)現(xiàn)，三七皂苷可顯著誘導小型家豬BMSCs中cTnT和β-MHC的表達，提示BMSCs在三七皂苷的定向誘導下可分化為心肌樣細胞。楊忠奇等[30]通過對中藥進行篩選，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷也能在體外成功誘導BMSCs分化為CM，且與經(jīng)典的心肌細胞分化誘導劑5-aza比較，兩者轉(zhuǎn)化率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

3.5 淫羊藿苷（ICA）

淫羊藿是傳統(tǒng)的補陽藥，除了補腎壯陽、強勁健骨之外，隨著現(xiàn)代藥理學的發(fā)展，其越來越多的新藥理功能被發(fā)現(xiàn)。研究[31]發(fā)現(xiàn)，把ICA誘導后的BMSCs通過尾靜脈注射輸入到心梗大鼠體內(nèi)，能促進BMSCs增殖，還能促進BMSCs中α-MHC、β-MHC mRNA的表達，提高心肌Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的基因表達，使受損的心肌被修復。在ICA誘導小鼠胚胎干細胞分化的研究中發(fā)現(xiàn)，由ICA誘導后的早期分化細胞已經(jīng)有心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白的合成，提示ICA可誘導小鼠胚胎干細胞向心肌樣細胞方向分化[32]。亦有實驗[33]證明ICA能促進BMSCs增殖并能協(xié)同5-aza誘導BMSCs向CM分化。

3.6 川芎嗪

川芎嗪可劑量依賴性地促進體外培養(yǎng)的BMSCs的增殖，它還可促進BMSCs表達趨化因子SDF-1及其受體CXCR4 mRNA的表達，有助于促進大鼠BMSCs向心肌梗死局部的歸巢，但在體外實驗并未發(fā)現(xiàn)川芎嗪能直接誘導BMSCs向心肌樣細胞轉(zhuǎn)化的證據(jù)[34]。

3.7 其他中藥及復方制劑

關(guān)于其他中藥或中藥單體誘導干細胞分化的報道還有益氣活血中藥[35]、絞股藍[36]、丹參注射液[37]、參附注射液[38]、雪蓮花[39]、地黃低聚糖[40]等。研究[41]表明，柴胡三參膠囊含藥血清在一定條件下能促進BMSCs的增殖，并可能通過p38-MAPK通路介導BMSCs向CM分化。復方丹參滴丸含藥血清體外可誘導大鼠BMSCs分化為心肌樣細胞，表現(xiàn)為α輔肌動蛋白（α-actinin）、結(jié)蛋白和肌球蛋白重鏈強陽性表達[42]。

4 小結(jié)與展望

中藥是中華醫(yī)學的寶貴財富，其內(nèi)涵博大精深。由于中藥的炮制方法講究，配伍形式多樣，服用劑量不同等，導致了中藥的雙向調(diào)節(jié)作用，故有些中藥對干細胞既有促進分化的作用，同時也有抑制分化的作用[43]。雖然中藥在誘導BMSCs向CM分化的研究中取得了良好的效果，但有些問題比較突出，例如尚未建立鑒定BMSCs的統(tǒng)一標準;BMSCs誘導分化為CM及移植后是如何治療心肌梗死和改善心功能的具體機制尚不明確;由異源細胞分化成的CM是否會導致心律失常等疾病;如何精準地控制BMSCs向CM分化，以及在進行中藥復方研究時很難確定有效成分、作用機制和作用靶點等。

中藥對干細胞的研究仍處在初級階段，隨著研究的逐漸深入，中藥在干細胞領(lǐng)域肯定會有重大發(fā)現(xiàn)，將中醫(yī)藥與干細胞移植聯(lián)系起來，也是中醫(yī)藥走向現(xiàn)代化的重要途徑。

[參考文獻]

[1]? Fukuhara S，Tomita S，Yamashiro S，et al. Direct cell-cell interaction of cardiomyocytes is key for bone marrow stromal cells to go into cardiac lineage in vitro [J]. J Thorac Cardiov Sur，2003，125（6）：1470-1480.

[2]? Melo LG，Pachori AS，Kong D，et al. Molecular and cell-based therapies for protection，rescue，and repair of ischemic myocardium - Reasons for cautious optimism [J]. Circulation，2004，109（20）：2386-2393.

[3]? Soltani L，Rahmani HR，Joupari MD，et al. Ovine fetal mesenchymal stem cell differentiation to cardiomyocytes，effects of co-culture，role of small molecules;reversine and 5-azacytidine [J]. Cell Biochem Funct，2016，34（4）：250-261.

[4]? Xing Y，Lv A，Wang L，et al. The combination of angiotensin Ⅱ and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Mol Cell Biochem，2012，360（1/2）：279-287.

[5]? Ling SK，Wang R，Dai ZQ，et al. Pretreatment of rat bone marrow mesenchymal stem cells with a combination of hypergravity and 5-azacytidine enhances therapeutic efficacy for myocardial infarction [J]. Biotechnol Prog，2011，27（2）：473-482.

[6]? Hafez P，Jose S，Chowdhury SR，et al. Cardiomyogenic differentiation of human sternal bone marrow mesenchymal stem cells using a combination of basic fibroblast growth factor and hydrocortisone [J]. Cell Biol Int，2016，40（1）：55-64.

[7]? Zhang GW，Liu XC，Li-Ling J，et al. Mechanisms of the protective effects of BMSCs promoted by TMDR with heparinized bFGF-incorporated stent in pig model of acute myocardial ischemia [J]. J Cell Mol Med，2011，15（5）：1075-1086.

[8]? Ybarra N，Vincent P，Smith LC，et al. Oxytocin improves the expression of cardiac specific markers in porcine bone marrow stem cells differentiation [J]. Res Vet Sci，2015， 98：42-50.

[9]? Wang Y，Zhang G，Wang H，et al. Preinduction with bone morphogenetic protein-2 enhances cardiomyogenic differentiation of c-kit + mesenchymal stem cells and repair of infarcted myocardium [J]. Int J Cardiol，2018，265：173-180.

[10]? 苗忠澄，高航.BMP-2預誘導骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠再灌注后心肌梗死的實驗研究[J].解放軍醫(yī)學雜志，2014，39（8）：601-608.

[11]? Shen X，Pan B，Zhou H，et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes is regulated by miRNA-1-2 via WNT signaling pathway [J]. J Biomed Sci，2017，24（1）：29.

[12]? Ren M，Wang T，Huang L，et al. Role of VR1 in the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes associated with Wnt / beta-catenin signaling [J]. Cardiovasc Ther，2016，34（6）：482-488.

[13]? Lobanok ES，Kvacheva ZB，Pinchuk SV，et al. The influence of fibroblast growth factor （FGF2） on cardiomyocytes differentiation of mesenchymal stem cells of bone marrow ex vivo [J]. Biofizika，2014，59（2）：360-368.

[14]? Ding R，Jiang X，Ha Y，et al. Activation of Notch1 signalling promotes multi-lineage differentiation of c-Kit（POS）/NKX2.5（POS） bone marrow stem cells：implication in stem cell translational medicine [J]. Stem Cell Res Ther，2015，6：91.

[15]? Yu Z，Zou Y，F(xiàn)an J，et al. Notch1 is associated with the differentiation of human bone marrowderived mesenchymal stem cells to cardiomyocytes [J]. Mol Med Rep，2016， 14（6）：5065-5071.

[16]? 劉昕超.豬骨髓間充質(zhì)干細胞體外向心肌樣細胞分化過程中Notch4下調(diào)[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學院，2009.

[17]? Wang C，Du H，Hou J，et al. Chaihulonggumulitang Shows Psycho-cardiology Therapeutic Effects on Acute Myocardial Infarction by Enhancing Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Mobilization [J]. Sci Rep-Uk，2018，8（1）：3724.

[18]? 孫敬和，冼紹祥，黃習文，等.中醫(yī)藥干預骨髓間充質(zhì)干細胞體外定向誘導分化為心肌細胞的研究進展[J].中藥新藥與臨床藥理，2012，23（1）：115-118.

[19]? 王怡，高秀梅，邢永發(fā)，等.丹參酚酸B、丹參酮治療心血管疾病的藥理學研究進展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2010， 44（7）：82-87.

[20]? Lv Y，Liu B，Liu Y，et al. TGF-beta1 combined with Sal-B promotes cardiomyocyte differentiation of rat mesenchymal stem cells [J]. Exp Ther Med，2018，15（6）：5359-5364.

[21]? Lv Y，Gao CW，Liu B，et al. BMP-2 combined with salvianolic acid B promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Kaohsiung J Med Sci，2017，33（10）：477-485.

[22]? Chen J，Wei J，Huang Y，et al. Danhong Injection Enhances the Therapeutic Efficacy of Mesenchymal Stem Cells in Myocardial Infarction by Promoting Angiogenesis [J]. Front Physiol，2018，9：991.

[23]? 張寶霞，張金生，張陽陽，等.三七總皂苷、紅景天苷、黃芪有效組分對心肌梗死大鼠模型骨髓間充質(zhì)干細胞動員作用研究[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（8）：137-142.

[24]? 宋雪云，龍云，譚超，等.黃芪甲苷聯(lián)合丹參酮Ⅱa誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化[J].中國組織工程研究，2013，17（36）：6515-6520.

[25]? 孫敬和.心肌樣微環(huán)境下黃芪甲苷聯(lián)合5-氮胞苷誘導MSCs分化為心肌樣細胞[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2012.

[26]? 王樂，田立，鄭明奇，等.人參皂苷Rh2干預催產(chǎn)素誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞的轉(zhuǎn)化[J].中國組織工程研究，2015，19（23）：3633-3638.

[27]? 汪朝暉，冼紹祥，楊忠奇，等.人參總皂甙誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞的實驗研究[J].廣州中醫(yī)藥大學學報，2006，23（2）：100-103.

[28]? 王俊東，崔勇，王建國，等.人參皂苷Rh3預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2017，35（11）：2783-2786.

[29]? 孔曉丹，曲鵬，王彥，等.三七皂甙誘導骨髓基質(zhì)細胞分化為心肌樣細胞的實驗研究[J].中國心血管病研究雜志，2005，3（7）：528-530.

[30]? 楊忠奇，冼紹祥，汪朝暉，等.三七總皂苷對骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞的作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2006，17（4）：239-242.

[31]? 謝玲玲.淫羊藿苷誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化心肌樣細胞的實驗研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2008.

[32]? 孫曉冬，董韜，于宏偉，等.淫羊藿苷體外誘導小鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞[J].解剖科學進展，2011，17（2）：124-127.

[33]? 劉韶英.淫羊藿苷對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及向心肌細胞分化的影響[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2008.

[34]? 戴儒麗.川芎嗪對骨髓間質(zhì)干細胞增殖、SDF-1mRNA表達及向心肌樣細胞分化的實驗研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2010.

[35]? 謝娟.益氣活血中藥對骨髓間充質(zhì)干細胞向缺血心肌遷移的影響及其機制研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學，2012.

[36]? 陳梅，王立新.中藥聯(lián)合干細胞療法治療缺血性腦卒中的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（19）：218-226.

[37]? 林惠.丹參注射液干預腦梗死大鼠SVZ干細胞增殖作用的研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2014.

[38]? 李榮，王向培，王創(chuàng)暢，等.參附注射液預處理對5-氟胞苷體外誘導兔骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細胞的實驗研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2015，26（6）：765-770.

[39]? 張愛國，蔡建平，譚湘陵，等.五種中藥對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖活性的作用[J].遼寧中醫(yī)雜志，2012，39（1）：158-161.

[40]? 王新華，王士雯，李泱，等.地黃低聚糖誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的實驗研究[J].解放軍醫(yī)學雜志，2009，34（4）：412-414.

[41]? 雷婁芳.柴胡三參膠囊含藥血清對P38MAPK通路介導BMSCs向心肌細胞分化的干預研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2017.

[42]? 武重陽，孫蘭軍，趙英強，等.復方丹參滴丸含藥血清誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞[J].中國老年學雜志，2010，30（16）：2328-2330.

[43]? 李偉娟，謝保平，石麗穎，等.從ERα/RANK通路探討淫羊藿苷抑制破骨細胞分化作用[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（7）：121-126.

（收稿日期：2019-02-20? 本文編輯：王? ?蕾）