姚榮成 劉韜 何波 楊仁華 沈志強 陳鵬

摘 要 目的：考察七參連濕疹膏對特應(yīng)性皮炎（AD）模型豚鼠的改善作用，并探討其可能機制。方法：將雌性豚鼠隨機分為正常對照組，模型對照組，基質(zhì)對照組（七參連濕疹膏基質(zhì)，1 g/kg），七參連濕疹膏低、中、高劑量組（0.5、1、2 g/kg）和丁酸氫化可的松乳膏組（0.5 g/kg），每組10只。以卵清蛋白為抗原，激發(fā)豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)以復制AD模型。末次激發(fā)48 h后，正常對照組和模型對照組豚鼠涂以生理鹽水，基質(zhì)對照組豚鼠涂以七參連濕疹膏基質(zhì)，各給藥組豚鼠涂以相應(yīng)藥物；每天2次，連續(xù)14 d。記錄各組豚鼠給藥前后的紅斑、水腫、抓痕等癥狀評分；采用蘇木精-伊紅染色法觀察豚鼠皮膚組織形態(tài)學特征；采用TUNEL法檢測豚鼠皮膚組織角質(zhì)形成細胞凋亡情況；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測豚鼠皮膚組織干擾素γ（IFN-γ）水平。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組和基質(zhì)對照組豚鼠皮膚組織中均可見炎癥細胞浸潤、表皮角化過度、棘層增厚等癥狀，其紅斑、水腫、抓痕評分及總評分和皮膚組織中IFN-γ水平均顯著升高，角質(zhì)形成細胞凋亡數(shù)均顯著減少（P<0.01）。與模型對照組和基質(zhì)對照組比較，各給藥組豚鼠上述癥狀均有不同程度的減輕，其中各給藥組豚鼠給藥后的紅斑、水腫、抓痕評分及總評分以及七參連濕疹膏中、高劑量組和丁酸氫化可的松乳膏組豚鼠皮膚組織中IFN-γ水平均顯著降低，且給藥組上述評分均顯著低于同組給藥前（P<0.05或P<0.01）；各給藥組豚鼠角質(zhì)形成細胞凋亡數(shù)均顯著增加（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：七參連濕疹膏對AD模型豚鼠具有一定的改善作用，這種作用可能與促進角質(zhì)形成細胞凋亡、降低皮膚組織INF-γ水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 七參連濕疹膏；特應(yīng)性皮炎；癥狀評分；角質(zhì)形成細胞；干擾素γ；豚鼠；機制

Study on Improvement Effects of Qishenlian Eczema Cream on the Atopic Dermatitis Model Guinea Pigs

YAO Rongcheng1，LIU Tao2，HE Bo3，YANG Renhua3，SHEN Zhiqiang3，CHEN Peng3（1. Dept. of Drug and Equipment， Qujing First Peoples Hospital， Yunnan Qujing 655000， China； 2. Dept. of Pharmacy， Honghe Vocational College of Health， Yunnan Honghe 661100， China； 3. Pharmaceutical College ， Kunming Medical University/Yunnan Province Key Lab of Pharmacology for Natural Products， Kunming 650500， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the improvement effects of Qishenlian eczema cream on the atopic dermatitis （AD） model guinea pigs， and to investigate its possible mechanism. METHODS： Female guinea pigs were randomly divided into normal control group， model control group， matrix control group （Qishenlian eczema cream matrix， 1 g/kg）， Qishenlian eczema cream low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.5， 1， 2 g/kg） and Hydrocortisone butyrate cream group （0.5 g/kg）， with 10 guinea pigs in each group. Using ovalbumin as antigen， the skin allergy of guinea pigs was stimulated to induce AD model. Forty-eight hours after the last excitation， guinea pigs were smeared with normal saline in normal control group and model control group， while those were smeared with Qishenlian eczema cream matrix in matrix control group， and administration groups were treated with relevant medicine， twice a day， for consecutive 14 d. The scores of erythema， edema and scratch before and after administration were recorded in each group. The morphological characteristics of skin were observed by HE staining. TUNEL method was used to detect the apoptosis of keratinocytes in skin tissue. The level of IFN-γ in skin lesions was detected by ELISA. RESULTS： Compared with normal control group， inflammatory cell infiltration， hyperkeratosis of epidermis and thickening of spinous layer were observed in skin tissue of guinea pigs in model control group and matrix control group； the scores of erythema， edema and scratch and their total score， the level of IFN-γ in skin tissue were increased significantly； the apoptosis number of keratinocytes was decreased significantly （P<0.01）. Compared with model control group and matrix control group， above symptoms of medication groups were relieved to different extents； the scores of erythema， edema and scratch and their total score after medication in medication groups， the level of IFN-γ in skin tissue in Qishenlian eczema cream medium-dose and high-dose groups and Hydrocortisone butyrate cream group were decreased significantly， and above scores in medication groups were significantly lower than before medication （P<0.05 or P<0.01）； the apoptosis number of keratinocytes was increased significantly in medication groups （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Qishenlian eczema cream has certain improvement effect on AD model guinea pigs， the mechanism of which may be associated with promoting the keratinocyte apoptosis， reducing the level of INF-γ in skin tissue.

KEYWORDS Qishenlian eczema cream； Atopic dermatitis； Symptom score； Keratinocyte apoptosis； IFN-γ； Guinea pigs； Mechanism

濕疹（Eczema）是皮膚科臨床常見的一類變態(tài)反應(yīng)性皮膚病，主要包括變應(yīng)性接觸性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD）、濕疹和特應(yīng)性皮炎（Atopic dermatitis，AD）。目前，學者普遍認為濕疹是由機體內(nèi)、外因共同作用所致，且易反復發(fā)作[1-2]。其中，AD是由活化的T輔助淋巴細胞2（Th2）、嗜酸性粒細胞和肥大細胞之間復雜的相互作用所導致的，以炎癥細胞浸潤為主要機制，以反復發(fā)作、多形性皮損、皮膚干燥、劇烈瘙癢等為基本臨床特征的炎癥性皮膚病，其發(fā)病可能與遺傳因素所致的免疫失常、皮膚屏障功能障礙以及環(huán)境因素等密切相關(guān)[3-4]。AD的臨床治療主要包括含糖皮質(zhì)激素、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑的外用藥物治療和含抗組胺藥、抗炎癥介質(zhì)藥物、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的系統(tǒng)治療[5]。但上述藥物可能造成嗜睡、口干、乏力、皮膚色素沉著及皮膚萎縮等不良反應(yīng)，長期應(yīng)用可能導致耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，且存在一定的停藥反應(yīng)（如皮損加重、激素依耐性皮炎等），導致其臨床應(yīng)用受到極大限制[6-7]。

中醫(yī)認為，濕疹的發(fā)病主因為“風”“濕”“熱”[8-9]。有研究指出，中醫(yī)藥對濕疹的治療獨具優(yōu)勢，能通過多種途徑祛風利濕、清熱潤燥、抗過敏，具有療效好、副作用少的優(yōu)點，受到學者的普遍關(guān)注[9]。七參連濕疹膏由黃連、苦參、蒼術(shù)、重樓、三七、白鮮皮、爐甘石、花椒、冰片、甘草等藥材組成，具有清熱燥濕、活血消腫、祛風止癢之功效，臨床用于治療因風濕熱毒瘀阻所致的AD，效果肯定[10-11]，但其基礎(chǔ)研究證據(jù)有限。為此，本研究以卵清蛋白（OVA）誘導的AD模型豚鼠為對象，對七參連濕疹膏的藥效學進行評價，并探索其可能的作用機制，旨在為該藥的臨床應(yīng)用及機制明確提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MK3型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司）；CX21 FS1型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；03024R型高速冷凍型離心機（美國Scilogex公司）；Scientz-950E型超聲波破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

七參連濕疹膏（批準文號：國藥準字B20020421，批號：20160402，規(guī)格：15 g/支）；七參連濕疹膏基質(zhì)（由氫氧化鉀、三乙醇胺、乙醇、硬脂酸、甘油、硬脂醇、液體石蠟等組成，批號：20160402）均購自云南藍綠康藥業(yè)有限公司；丁酸氫化可的松乳膏[陽性對照，天津金輝藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H10940095，批號：20151002，規(guī)格：0.1%（10 g ∶ 10 mg）]；OVA（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司，批號：F20010702，純度：98%）；干擾素γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（美國RayBiotech公司，批號：0828150131）；TUNEL試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：07E16BM）；十二烷基硫酸鈉（SDS）（美國Amresco公司，批號：151-21-3）；醫(yī)用白凡士林（甘肅潤康藥業(yè)有限公司，批號：20140604）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號：201550730）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：60882801）；RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)公司，批號：P0013B）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

普通級雌性豚鼠，2月齡，體質(zhì)量320～350 g，由昆明醫(yī)科大學提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇）K2015-0005。所有動物均于通風環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將豚鼠隨機分為正常對照組，模型對照組，基質(zhì)對照組（七參連濕疹膏基質(zhì)，1 g/kg），七參連濕疹膏低、中、高劑量組[0.5、1、2 g/kg；劑量根據(jù)本課題組前期皮膚刺激性和過敏性試驗結(jié)果（安全劑量≤2 g/kg）設(shè)定]和丁酸氫化可的松乳膏組（0.5 g/kg；該藥藥品說明書并未注明外用劑量，本研究劑量根據(jù)均勻涂滿致敏皮膚區(qū)域預估），每組10只。除正常對照組外，其余各組豚鼠均按文獻[12]方法復制豚鼠AD模型：在每只動物背部兩側(cè)去毛，每側(cè)面積約為2 cm×3 cm。豚鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）進行麻醉，在左側(cè)去毛處皮內(nèi)注射OVA-氫氧化鋁溶液（每10 mL生理鹽水中含OVA 10 μg、氫氧化鋁0.5 mg）100 μL。注射1周后，用紗布（3 cm×4 cm）將10%OVA+10%SDS+30%凡士林+50%水（g/mL，下同）敷于去毛處，保持48 h；注射后3周后，用紗布（3 cm×4 cm）將10%OVA+5%SDS+37%凡士林+48%水敷于去毛處，保持48 h；休息1周后，用雙層紗布（1 cm×1 cm）將10%OVA+70%凡士林+20%水敷于去毛處，保持24 h，進行抗原激發(fā)反應(yīng)。右側(cè)去毛處用不含OVA、SDS、氫氧化鋁、凡士林的濕紗布同法處理，作為自身對照。末次激發(fā)48 h后，對致敏的左側(cè)皮膚進行處理：正常對照組和模型對照組豚鼠均涂以生理鹽水（1 mL/kg），基質(zhì)對照組豚鼠涂以七參連濕疹膏基質(zhì)，各給藥組豚鼠均涂以相應(yīng)藥物；每天2次，連續(xù)14 d。

2.2 癥狀評分

造模后，分別于給藥前后按如下標準對各組豚鼠致敏側(cè)的皮膚癥狀進行評分[12]——（1）紅斑：無為0分，輕微紅斑為1分，明顯紅斑但無痂皮為2分，中、重度紅斑伴輕、中度痂皮為3分，重度紅斑伴重度痂皮為4分；（2）水腫：無為0分，輕度為1分，中、重度為2分；（3）抓痕：無為0分，有為1分。總評分為上述各項評分之和。

2.3 皮膚組織形態(tài)學觀察

末次用藥24 h后，處死豚鼠，取致敏側(cè)（正常對照組取同側(cè)）皮膚組織適量，用10%中性福爾馬林溶液固定24 h后，切片（厚度約4 μm），經(jīng)HE染色后，使用光學顯微鏡觀察各組豚鼠皮膚組織的病理學變化和炎癥細胞浸潤情況[鏡下炎癥細胞（主要是淋巴細胞和單核細胞）呈點狀，以藍色為主。其中，淋巴細胞小而圓，胞漿稀少，核呈紫藍色；單核細胞體積大，胞漿淡紅，核卵呈圓形、深藍色]。

2.4 皮膚組織角質(zhì)形成細胞凋亡情況檢測

采用TUNEL法檢測。取各組豚鼠致敏側(cè)（正常對照組取同側(cè)）皮膚組織適量，用10%中性福爾馬林溶液固定24 h后，切片（厚度約5 ?m），經(jīng)常規(guī)貼片、烤片后，行常規(guī)脫蠟、水化，用TUNEL試劑盒染色，再用DAB顯色，以水終止顯色反應(yīng)，行常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。于光學顯微鏡下觀察并拍照，直接計數(shù)視野中TUNEL染色陽性細胞數(shù)[呈深棕褐色的細胞即為凋亡陽性角質(zhì)形成細胞（胞核著色，呈圓形）]。每個組織切片取4個視野分別進行計數(shù)后，取均值作為該切片的TUNEL陽性細胞數(shù)；每個樣本取3張組織切片進行上述計數(shù)后，取均值作為該樣本的TUNEL陽性細胞數(shù)。

2.5 皮膚組織中IFN-γ水平檢測

采用ELISA法檢測。取各組豚鼠致敏側(cè)（正常對照組取同側(cè)）皮膚組織適量，用眼科剪剪碎，于液氮下研磨后，加入RIPA裂解液800 μL，于冰浴下超聲（功率：100 W，頻率：20 kHz）勻漿30 s，以3 000 r/min離心20 min后，收集上清液，以酶標儀于450 nm波長處檢測IFN-γ水平，嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）或LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組豚鼠紅斑、水腫、抓痕評分及總評分比較

給藥前，模型對照組、基質(zhì)對照組和各給藥組豚鼠的紅斑、水腫、抓痕評分及總評分均較正常對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；給藥后，各給藥組豚鼠的上述評分均較模型對照組和基質(zhì)對照組顯著降低，且顯著低于同組給藥前，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 各組豚鼠皮膚組織形態(tài)學觀察

正常對照組豚鼠表皮無增厚，真皮下層未見毛細血管擴張或炎癥細胞浸潤，真皮層結(jié)構(gòu)規(guī)整，無明顯細胞間或細胞內(nèi)水腫。模型對照組豚鼠真皮淺層小血管周圍可見輕度以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，毛細血管數(shù)量增多，內(nèi)皮細胞腫脹并增生，皮膚表皮角化過度，棘層肥厚?；|(zhì)對照組豚鼠皮膚組織被覆鱗狀上皮，角化過度，表皮層的顆粒層及棘層增厚，真皮淺層有慢性炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞、單核細胞為主。各給藥組豚鼠皮膚上述癥狀均有不同程度的改善，其中七參連濕疹膏高劑量組和丁酸氫化可的松組改善更明顯，詳見圖1。

3.3 各組豚鼠皮膚組織角質(zhì)形成細胞凋亡情況比較

正常對照組豚鼠皮膚組織中可見著色明顯的圓形陽性染色細胞，且伴有核固縮；模型對照組和基質(zhì)對照組豚鼠皮膚組織中的角質(zhì)形成細胞增殖明顯增多、凋亡明顯減少，其陽性染色細胞數(shù)均較正常對照組顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；各給藥組豚鼠皮膚組織中角質(zhì)形成細胞凋亡明顯增多，其陽性染色細胞數(shù)均較模型對照組和基質(zhì)對照組顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表2。

3.4 各組豚鼠皮膚組織中IFN-γ水平比較

與正常對照組比較，模型對照組和基質(zhì)對照組豚鼠皮膚組織中IFN-γ水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型對照組和基質(zhì)對照組比較，七參連濕疹膏中、高劑量組和丁酸氫化可的松乳膏組豚鼠皮膚組織中IFN-γ水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

4 討論

AD動物模型包括OVA激發(fā)豚鼠模型、NC/Nga小鼠模型、半抗原誘導小鼠模型、轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠模型，其中OVA激發(fā)豚鼠模型較為常用[13]。OVA是雞蛋清中所含的主要蛋白質(zhì)，是AD病情加重的主要變應(yīng)原，其腹腔注射、皮膚接觸或霧化吸入均能誘導實驗動物發(fā)生AD[14]；此外，OVA反復激發(fā)豚鼠AD模型的病理基礎(chǔ)與該癥的發(fā)病機制較為一致[15]。因此，本研究選擇OVA誘導AD模型豚鼠作為對象。目前，臨床就糖皮質(zhì)激素外用治療濕疹已達成共識，臨床證據(jù)表明，丁酸氫化可的松乳膏的臨床療效確切，且安全性較高[16-17]，故本研究選用該藥作為陽性對照藥物。

七參連濕疹膏組方中的黃連、苦參、蒼術(shù)、白鮮皮可清熱燥濕、瀉火解毒、殺菌止癢，重樓、三七可清熱消腫、活血止痛，爐甘石可收斂生肌，花椒、冰片可殺蟲止痛，甘草可緩急止痛、調(diào)和諸藥；諸藥合用，共奏清熱燥濕、活血消腫、祛風止癢之功效[10-11]。本研究考察了七參連濕疹膏對AD豚鼠模型的改善作用，結(jié)果顯示，造模后、給藥前，模型對照組、基質(zhì)對照組和各給藥組豚鼠皮膚組織均可見炎癥細胞浸潤、表皮角質(zhì)化過度、棘層增厚等癥狀，其紅斑、水腫、抓痕評分及總評分均較正常對照組顯著升高，提示模型復制成功。經(jīng)不同劑量七參連濕疹膏或丁酸氫化可的松乳膏處理后，各給藥組豚鼠皮膚組織上述癥狀均有不同程度的好轉(zhuǎn)，且七參連濕疹膏高劑量組和丁酸氫化可的松組改善更明顯；各給藥組豚鼠紅斑、水腫、抓痕評分及總評分均較模型對照組和基質(zhì)對照組顯著降低，且顯著低于同組治療前，提示七參連濕疹膏對OVA誘發(fā)的AD具有一定的治療作用。

濕疹的發(fā)生發(fā)展與角質(zhì)形成細胞的凋亡密切相關(guān)，該癥的主要病變部位為皮膚表皮，角質(zhì)形成細胞則是表皮的主要組成細胞。當AD發(fā)生時，皮膚組織中的T淋巴細胞被激活，后者產(chǎn)生的炎癥細胞因子可通過殺傷介質(zhì)誘導角質(zhì)形成細胞凋亡，從而啟動角質(zhì)形成細胞的修復機制，使得該細胞快速增殖，最終導致AD的表皮、棘層增厚；與此同時，過度增生的角質(zhì)形成細胞可分泌多種細胞因子，使得局部組織再次損傷，進一步加重AD所致的炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，正常對照組豚鼠皮膚組織中可見明顯的著色陽性細胞，且伴有核固縮，提示角質(zhì)形成細胞呈凋亡狀態(tài)；模型對照組和基質(zhì)對照組豚鼠皮膚組織中的陽性染色細胞顯著減少，提示角質(zhì)形成細胞增殖明顯增多、凋亡明顯減少；經(jīng)不同劑量七參連濕疹膏處理后，各給藥組豚鼠皮膚組織中陽性染色細胞均較模型對照組和基質(zhì)對照組顯著增加，提示七參連濕疹膏可抑制角質(zhì)形成細胞增殖、促進其凋亡。

AD是由T細胞介導的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，以Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)為主，其中Th1/Th2的動態(tài)失衡導致的IFN-γ等細胞因子分泌紊亂在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[20-21]。IFN-γ不僅能促進Th1細胞的成熟、抑制Th2細胞的增殖，同時還能抑制B淋巴細胞產(chǎn)生免疫球蛋白E（IgE），從而減少超敏反應(yīng)的發(fā)生[22]。由此可見，IFN-γ是反映Th1/Th2細胞免疫應(yīng)答參與程度及平衡狀態(tài)的重要指標之一。有臨床研究表明，AD患者血清中IFN-γ水平升高，Th1細胞亞群功能明顯增強，并伴有Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的臨床和病理表現(xiàn)[23]。本研究結(jié)果顯示，模型對照組和基質(zhì)對照組豚鼠皮膚組織中IFN-γ水平較正常對照組顯著升高，提示AD可能促發(fā)并維持了機體內(nèi)炎癥細胞的浸潤。經(jīng)給藥處理后，七參連濕疹膏中、高劑量組和丁酸氫化可的松乳膏組豚鼠皮膚組織中IFN-γ水平均較模型對照組和基質(zhì)對照組顯著降低，提示七參連濕疹膏可降低AD模型豚鼠體內(nèi)炎癥細胞因子水平。

綜上所述，七參連濕疹膏對AD模型豚鼠具有一定的改善作用，這種作用可能與促進角質(zhì)形成細胞凋亡、降低皮膚組織IFN-γ水平有關(guān)。但AD的發(fā)病機制復雜且誘發(fā)因素較多，具體作用機制仍有待后續(xù)研究進一步深入探索。

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（收稿日期：2018-10-08 修回日期：2019-04-02）

（編輯：張元媛）