何鋒　陸小蘭　滕寶松

【摘? 要】目的：將傳統(tǒng)提取工藝與膜分離技術(shù)聯(lián)用對(duì)麥冬多糖進(jìn)行分離純化，并考察其多糖含量。方法：采用L₉（4³）正交試驗(yàn)對(duì)麥冬多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化;采用不同分子量級(jí)別的超濾膜對(duì)麥冬多糖進(jìn)行精制分離研究。結(jié)果：麥冬多糖最佳提取條件為95°C，提取2次，每次2h。Sevage法蛋白脫除率高。檢測(cè)了超濾膜分級(jí)研究所得的各組分多糖含量。結(jié)論：本研究?jī)?yōu)選的工藝在技術(shù)上是合理的、可行的，合適的超濾膜可以將麥冬多糖進(jìn)行很好的分級(jí)純化。

【關(guān)鍵詞】麥冬;膜分離;多糖

【中圖分類號(hào)】R914;R96?? ???【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A?? ???【文章編號(hào)】1004-7484（2020）09-0296-02

Extraction， separation and content determination of Polysaccharide from Ophiopogon japonicus

【Abstract】Objective：The polysaccharide of Ophiopogon japonicus was separated and purified by the combination of traditional extraction technology and membrane separation technology， and the content of polysaccharide was investigated.MethodsL9 （4³） orthogonal test was used to optimize the extraction process of Ophiopogon japonicus polysaccharide. The purification and separation of Polysaccharide from Ophiopogon japonicus was studied by ultrafiltration membrane with different molecular weight.ResultThe best extraction condition of Ophiopogon japonicus polysaccharide was 95 °C， 2 times， 2 hours each time. High protein removal rate of Sevage method. The content of polysaccharide in each component of ultrafiltration membrane was determined.ConclusionThe optimal technology of this study is reasonable and feasible， and the suitable ultrafiltration membrane can carry out a good classification and purification of Ophiopogon japonicus polysaccharide.

【Key words】Ophiopogon japonicus; Membrane separation; polysaccharides

中藥麥冬（Ophiopogon japonicus （Linn. f.） Ker-Gawl.）為百合科沿階草屬多年生常綠草本植物干燥塊根，味苦、微苦、性微寒。入心、肺、胃經(jīng)。有養(yǎng)陰生津，潤(rùn)肺清心^[1]的功效，是中醫(yī)藥寶庫(kù)中的珍品?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，麥冬的化學(xué)成分比較豐富，含有多糖、甾體皂苷、高異黃酮類、氨基酸等。具有多種藥理作用，能夠增加機(jī)體耐缺氧能力;降血糖，促進(jìn)胰島細(xì)胞的恢復(fù);提高機(jī)體免疫能力等作用^[2]。

膜分離技術(shù)是一項(xiàng)新型的高效分離技術(shù)，它是在分子水平上，不同粒徑分子的混合物在通過(guò)半透膜時(shí)，選擇性分離的技術(shù)，根據(jù)膜上小孔的實(shí)際大小，可將其分為微濾膜、超濾膜、納濾膜和反滲透膜等^[3]。目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及環(huán)保水處理等各個(gè)領(lǐng)域^[4-5]。膜分離技術(shù)以選擇性透過(guò)膜為分離遞質(zhì)，當(dāng)膜兩側(cè)存在一定電位差、濃度差或壓力差時(shí)，原料一側(cè)的組分就會(huì)選擇性地透過(guò)膜，從而實(shí)現(xiàn)大、小分子的分離，達(dá)到有效成分凈化濃縮的目的^[6-8]。

超濾技術(shù)是膜分離技術(shù)的一種，是以0.1～0.5 MPa的壓力差為推動(dòng)力，利用多孔膜的攔截能力，以物理截留的方式，將溶液中不同大小的物質(zhì)顆粒分開，從而達(dá)到純化和濃縮、篩分溶液中不同組分的目的 ^[9]。 超濾主要用于從液相物質(zhì)中分離大分子化合物（蛋白質(zhì)，核酸聚合物，多糖，天然膠等），膠體分散液（粘土，顏料，礦物料，孔液粒子，微生物），乳液（潤(rùn)滑脂-洗滌劑以及油-水乳液）。其操作靜壓差一般為0.1-0.5MPa，被分離組分的直徑大約為0.01-0.1μm，一般為分子量范圍0.5KDa-1000KDa的大分子和膠體粒子^[10-11]。

1儀器與材料

UV-2600/2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津;W201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司;LGJ-10D冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;TGL-20B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器;LNG-HFM-10實(shí)驗(yàn)室膜分離設(shè)備，上海朗極膜分離設(shè)備工程有限公司;1000KDa、500KDa、100KDa、30KDa超濾膜，上海朗極膜分離設(shè)備工程有限公司;1KDa透析袋，上海源葉生物科技有限公司。

麥冬干燥塊根購(gòu)自綿陽(yáng)市川誠(chéng)豪宇麥冬開發(fā)有限責(zé)任公司;95%乙醇、濃硫酸、氯仿和正丁醇購(gòu)自上海振興化工一廠;苯酚購(gòu)自江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司;葡萄糖購(gòu)自北京華爾博科技有限公司;Tris購(gòu)自上海希美生物科技有限公司;Lowry蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海荔達(dá)生物科技有限公司;檸檬酸購(gòu)自上海科興生物科技有限公司;檸檬酸鈉購(gòu)自上海佳倫生物科技有限公司;水為純化水。

2方法與結(jié)果

2.1多糖含量的測(cè)定

1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取葡萄糖20mg于500mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6及1.8 mL，各以水補(bǔ)至2mL，然后加入6%苯酚1mL，靜止10min，然后加入濃硫酸5mL，搖勻，室溫放置20min后于490nm測(cè)光密度，以2mL水按同樣操作為空白，以橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為光密度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y = 0.2904X+ 0.0271， R²=0.9953，線性范圍為0.025～0.150mg/mL。

2）樣品含量測(cè)定：吸取樣品液1mL（相當(dāng)于40μg左右的多糖），加水1mL，然后加入6%苯酚1mL，靜止10min，然后加入濃硫酸5mL，搖勻，室溫放置20min后于490nm測(cè)光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

2.2蛋白含量的測(cè)定

1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確配置濃度為0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL，加入試劑A （含Cu²⁺的堿性試劑）2.5mL，混勻后室溫放置10min。各管加入試劑B（酚試劑即磷鎢酸-磷鉬酸不用稀釋，直接使用）0.25mL，每加一管必須立即混勻，室溫放置30min，然后在650nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收，以橫坐標(biāo)為蛋白濃度，縱坐標(biāo)為光密度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y =13.866X+ 0.0668，R²=0.9943。

2）樣品含量測(cè)定：各管加入待測(cè)溶液0.5mL，空白對(duì)照用0.5mL生理鹽水或蒸餾水來(lái)替代待測(cè)溶液。各管加入試劑A 2.5mL，混勻后室溫放置10min，各管加入試劑B 0.25mL。

2.3多糖的提取

2.3.1工藝流程

麥冬塊根干品用粉碎機(jī)粉碎，稱取10g麥冬粉碎后樣品，以蒸餾水作為溶劑，按一定浸提溫度、浸提時(shí)間和浸提次數(shù)進(jìn)行浸提，冷卻濾過(guò)，合并濾液，離心棄沉淀得上清液，上清液經(jīng)濃縮后，加入4倍量95%乙醇進(jìn)行沉淀，靜置過(guò)夜。離心所得沉淀加適量水溶解，Sevage試劑（氯仿-正丁醇=4：1）除蛋白3次，將脫蛋白后粗多糖用膜分離技術(shù)進(jìn)行純化精制。

2.3.2單因素試驗(yàn)

參照“2.3.1”項(xiàng)工藝流程，每次稱取10g麥冬粉碎后樣品，考察浸提溫度、浸提時(shí)間和浸提次數(shù)對(duì)麥冬多糖提取率的影響。

2.3.2.1浸提溫度對(duì)多糖提取率的影響

在浸提時(shí)間2h，提取2次的條件下，考察不同浸提溫度55°C、75°C、95°C對(duì)麥冬多糖提取率的影響，結(jié)果分別為2.78%、5.43%、7.67%?？梢钥闯鲭S著溫度的升高，多糖提取率也隨之提高。

2.3.2.2浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

在浸提溫度95°C，提取2次的條件下，考察不同浸提時(shí)間1h、2h、3h對(duì)麥冬多糖提取率的影響，結(jié)果分別為3.77%、7.65%、8.23%。可以看出隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率不斷升高，但當(dāng)浸提時(shí)間大于2h，多糖提取率增加幅度降低。

2.3.2.3浸提次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

在浸提溫度95°C，浸提時(shí)間2.0h條件下，按照浸提次數(shù)為1、2、3次對(duì)麥冬多糖提取率的影響，結(jié)果分別為4.31%、7.63%、7.95%?？梢钥闯鲭S著浸提次數(shù)的增加，多糖提取率不斷升高，當(dāng)浸提次數(shù)大于2次時(shí)，提取率升高幅度不大。

2.3.3正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平L₉（4³）正交試驗(yàn)，考察浸提溫度（A）、浸提時(shí)間（B）和浸提次數(shù)（C）對(duì)多糖提取率的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，3個(gè)因素對(duì)麥冬多糖提取率的影響依次為浸提次數(shù)>浸提溫度>浸提時(shí)間。最優(yōu)工藝為A₃B₂C₂，即浸提溫度95°C，浸提時(shí)間2h，浸提次數(shù)2次。

2.4脫蛋白實(shí)驗(yàn)

Sevage法：取3g多糖粗粉溶解成25mL多糖水溶液，按多糖水溶液-氯仿-正丁醇=25：24：1的比例充分混合后萃取3次，得上清液，濃縮冷凍干燥后得脫蛋白后多糖。用Lowry法檢測(cè)后證明脫蛋白前多糖粗粉蛋白含量為17.86%，脫蛋白后蛋白含量為1.47%，脫除率高達(dá)91.8%。

2.5麥冬多糖超濾膜分離研究

超濾膜分離的關(guān)鍵在于膜型號(hào)的選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇1000KDa、500KDa、100KDa、30KDa分子量級(jí)別的超濾膜將麥冬多糖進(jìn)行分級(jí)純化。

將麥冬脫蛋白后的粗多糖配成質(zhì)量濃度為0.05g/mL水溶液1L，先經(jīng)1000KDa超濾膜超濾分離，1L料液結(jié)束后用純化水頂洗0.5L，得1.4L透過(guò)液和0.1L濃縮液（F1），將透過(guò)液全部進(jìn)行500KDa超濾膜超濾分離，并加水頂洗0.7L，得2.0L透過(guò)液和0.2L濃縮液（F2），然后將透過(guò)液全部進(jìn)行100KDa超濾膜超濾分離，并加水頂洗1L，得2.7L透過(guò)液和0.3L濃縮液（F3），然后將透過(guò)液全部進(jìn)行30KDa超濾膜超濾分離，并加水頂洗1.5L，得0.5L濃縮液（F4）和3.7L透過(guò)液，取1L透過(guò)液用1KDa透析袋透析除鹽并旋蒸濃縮得組分F5。將F1-F5組分分別冷凍干燥，稱定質(zhì)量，計(jì)算得率（）。用苯酚硫酸法檢測(cè)超濾分級(jí)得到的各組分多糖含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3討論

麥冬自古以來(lái)就為人們所熟知，有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、益胃生津、清心除煩等功效。本實(shí)驗(yàn)將麥冬多糖傳統(tǒng)水提醇沉工藝與超濾膜分離技術(shù)相結(jié)合，對(duì)麥冬多糖進(jìn)行了精制分離。結(jié)果表明麥冬多糖水提工藝最佳條件為提取溫度95°C，提取2次，每次2h。Sevage法蛋白脫除率高，而且操作方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，能保證麥冬多糖的穩(wěn)定提取。

綜上所述，相比于傳統(tǒng)工藝，超濾膜分離技術(shù)在多糖的分離純化中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在運(yùn)作過(guò)程中無(wú)相變、無(wú)化學(xué)反應(yīng)可在最大程度上保留多糖活性。但膜分離過(guò)程中膜組件和膜清洗繁瑣等問(wèn)題還需要進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化。

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