劉文文，紀 芳，王華華

(河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

鋁毒是酸性土壤中限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最主要逆境因子。當土壤pH值<5.5時，結(jié)合態(tài)的鋁以Al3+的狀態(tài)釋放進土壤溶液中，對植物產(chǎn)生毒害[1]。鋁毒最顯著的特征是抑制植物根尖的伸長，影響植物對水分及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而導致植物生長受到抑制，造成農(nóng)作物減產(chǎn)。正常情況下，植物體內(nèi)活性氧(ROS)的生成和清除處于動態(tài)平衡。當ROS濃度超過正常水平時，即對細胞構(gòu)成氧化脅迫。鋁毒可引起植物體內(nèi)ROS過量積累，從而導致植物細胞遭受氧化傷害[2]。為了減輕和防止ROS造成的氧化損傷，植物體內(nèi)也存在著相應(yīng)的氧化應(yīng)激機制。其中，抗氧化酶系統(tǒng)是清除ROS的重要機制，主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化物酶(POD)等。

硫化氫(H2S)是繼NO和CO之后新發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性氣體信號分子。因其毒性以及對植物生長發(fā)育某些方面的不利影響，H2S長期以來一直被認為是一種植物毒素[3]。近些年來，H2S在植物中的多種生理學功能才逐漸被重新認識。研究表明，H2S作為信號分子參與調(diào)控植物的生長發(fā)育過程，如種子萌發(fā)、根器官的形成、氣孔運動等[4-6]；此外，H2S還參與了植物對多種脅迫環(huán)境的響應(yīng)，如鹽脅迫、缺氧脅迫、重金屬脅迫等[7-10]。盡管H2S參與植物逆境脅迫的響應(yīng)已有一些報道，但關(guān)于H2S在鋁毒中的調(diào)節(jié)作用及其調(diào)控機制尚不太清楚。鑒于此，利用H2S供體和抑制劑處理，探討了H2S在大豆耐鋁性中的調(diào)節(jié)作用及其機制，為進一步揭示大豆抗鋁毒脅迫信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制及篩選和培育抗鋁毒大豆品種提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及培養(yǎng)

供試大豆種子(JD39)由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院提供。選取大小一致的大豆種子，用清水浸泡后均勻放置在充分吸水的海綿上，種子表面覆蓋一層濕潤的紗布，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)48 h后，挑選根長約2 cm的大豆，于1/4Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光強150 μmol/(m2·s)，相對濕度70%，光/暗周期14 h/10 h。

1.2 試驗方法

1.2.1 鋁脅迫濃度篩選 采用AlCl3(下文以Al表示)模擬鋁脅迫處理。選取長勢一致的大豆幼苗轉(zhuǎn)入新鮮的1/4Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，分別移入到含0、25、50、100、200、500 μmol/L Al的營養(yǎng)液中處理24 h，測定根伸長量。

1.2.2 鋁脅迫時間篩選 選取長勢一致的大豆幼苗轉(zhuǎn)入新鮮的1/4Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，移入到含100 μmol/L Al的1/4Hoagland營養(yǎng)液中分別處理0、6、12、24 h，測定根尖H2S含量。

1.2.3 鋁脅迫下H2S對大豆生長發(fā)育及生理指標的影響 選取長勢一致的大豆幼苗轉(zhuǎn)入新鮮的1/4Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，分別進行以下處理：對照(CK)、NaHS(H2S供體)、HA(H2S抑制劑)、Al、Al+NaHS和Al+HA，處理時間為24 h，NaHS和HA處理添加濃度分別為25 μmol/L和100 μmol/L，Al處理濃度均為100 μmol/L，CK為正常1/4Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)。處理后收集主根用于各項指標的測定。

1.3 測定項目及方法

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個處理至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標準誤表示。用SPSS 18.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用單因素LSD法進行顯著性分析(P<0.05)，運用Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Al對大豆根伸長的影響

根尖是植物感知鋁毒害的最主要部位，根伸長量是反映植物遭受鋁毒害程度的關(guān)鍵指標。由圖1A可見，隨著鋁濃度升高，大豆根伸長量逐漸降低，當鋁濃度為100 μmol/L時，根伸長量降低33.0%，而當鋁濃度升高到500 μmol/L時，根的伸長則受到嚴重抑制，根伸長量降低71%。如圖1B所示，鋁處理不僅抑制了主根的生長，對側(cè)根生長也具有明顯的抑制作用，當鋁濃度達到100 μmol/L時，側(cè)根的數(shù)量及長度明顯減少，鋁濃度進一步增加，側(cè)根基本不再生長。根據(jù)試驗結(jié)果，選取100 μmol/L Al進行后續(xù)試驗。

2.2 鋁脅迫不同時間對大豆根尖H2S產(chǎn)生的影響

為了探究內(nèi)源H2S是否參與了大豆對鋁脅迫的響應(yīng)，檢測了鋁脅迫下根尖內(nèi)源H2S含量的變化情況。如圖2所示，100 μmol/L Al處理6 h根尖H2S含量顯著增加，隨著Al處理時間的延長，根尖內(nèi)的H2S含量逐漸升高，處理24 h根尖H2S含量約為處理0 h的3.3倍，表明鋁處理誘導了根尖內(nèi)源H2S的產(chǎn)生。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同

圖2 鋁脅迫處理不同時間對大豆根尖H2S含量的影響 Fig.2 Changes of H2S content in soybean root tips under Al stress for different time

2.3 鋁脅迫下H2S對大豆根伸長量及根尖相關(guān)生理指標的影響

2.3.1 根伸長量 根伸長受抑制程度是反映植物所受鋁毒害程度的重要指標。如圖3所示，100 μmol/L Al處理24 h后，根伸長量較CK降低約35.0%； Al+NaHS處理顯著緩解了鋁脅迫對根伸長的抑制作用，根伸長量較Al處理提高約36.7%，而Al+HA處理則進一步加重了鋁脅迫對根伸長的抑制作用，根伸長量較Al處理降低約24.8%。這些結(jié)果表明，H2S緩解了鋁脅迫對大豆根伸長的抑制作用。

圖3 鋁脅迫下H2S供體和抑制劑對大豆根伸長的影響 Fig.3 Effect of H2S donor and inhibitor on root elongation of soybean under Al stress

2.3.2 根尖鋁含量 根尖鋁含量的積累與植物鋁毒害有關(guān)。如圖4所示，與CK相比，100 μmol/L Al

圖4 鋁脅迫下H2S供體和抑制劑對大豆根尖鋁含量的影響Fig.4 Effect of H2S donor and inhibitor on Al content in soybean root tips under Al stress

處理24 h后，大豆根尖中吸收了大量的鋁，Al+NaHS處理根尖中的鋁含量顯著下降，較Al處理下降23.5%；而Al+HA處理根尖吸收的鋁含量進一步增加，較Al處理增加34.8%。這些結(jié)果表明，鋁脅迫下H2S降低了根尖鋁含量的積累，從而緩解了鋁毒害。

2.3.3 根尖細胞死亡率 鋁脅迫會導致根尖細胞死亡。如圖5所示，Al處理后，根尖細胞出現(xiàn)了明顯的死亡，細胞死亡率較CK增加了近2倍。Al+NaHS處理顯著降低了根尖細胞死亡率，而Al+HA處理則進一步提高了根尖細胞死亡率。這些結(jié)果表明，H2S可以緩解鋁脅迫造成的根尖細胞死亡情況。

圖5 鋁脅迫下H2S供體和抑制劑對大豆根尖細胞死亡率的影響Fig.5 Effect of H2S donor and inhibitor on cell death in soybean root tips under Al stress

圖6 鋁脅迫下H2S供體和抑制劑對大豆根尖MDA含量的影響Fig.6 Effect of H2S donor and inhibitor on MDA content in soybean root tips under Al stress

圖7 鋁脅迫下H2S供體和抑制劑對大豆根尖H2O2(A)和含量的影響Fig.7 Effect of H2S donor and inhibitor on H2O2(A)和 contents in soybean root tips under Al stress

2.4 鋁脅迫下H2S對大豆抗氧化酶活性的影響

如圖8所示，100 μmol/L Al處理24 h后，大豆CAT、APX、POD活性分別較CK提高59.0%、22.0%、13.0%；Al+NaHS處理進一步提高了CAT、APX、POD活性，與Al處理相比分別增加21.0%、30.0%、17.0%；而Al+HA處理CAT、APX、POD活性顯著下降。大豆SOD活性在Al處理后有所下降，但是Al+NaHS處理則顯著提高了SOD活性，而Al+HA處理則進一步降低了SOD活性。這些結(jié)果表明，鋁脅迫下H2S可以通過提高抗氧化酶活性來清除過多的活性氧，增強大豆抵抗鋁毒害的能力。

圖8 鋁脅迫下H2S供體和抑制劑對根尖抗氧化酶活性的影響Fig.8 Effect of H2S donor and inhibitor on the activities of antioxidant enzymes in soybean root tips under Al stress

3 結(jié)論與討論

綜上，鋁脅迫誘導大豆根尖ROS的積累，造成根尖膜脂過氧化，使根尖伸長受到抑制，導致大豆根生長抑制。H2S通過提高大豆幼苗根尖抗氧化酶活性，清除多余的ROS積累，減輕鋁毒害誘導的氧化脅迫，緩解其造成的大豆根系生長受抑。