李珮瑤，高晶萍，田 勇，王存連，徐明舉，利 凱，李 軍，張瑞華，蘭金蘋，徐 彤,

(1.河北北方學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院 生命科學(xué)研究中心，河北 張家口 075000)

鴿新城疫是由鴿Ⅰ型副黏病毒(Pigeon paramyxovirusⅠ,PPMV-Ⅰ)引起的常流行于鴿群的高度接觸性傳染病，臨床主要表現(xiàn)為鴿群腸炎、下痢、扭頭轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀[1]，因發(fā)病癥狀與雞新城疫神經(jīng)型相似，故將其稱為鴿新城疫，是危害鴿養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一。鴿新城疫起源于20世紀(jì)70年代末的中東地區(qū)[2]，在世界各地均有發(fā)生。我國(guó)肉鴿、賽鴿以及觀賞的鴿子數(shù)量龐大，尤其因賽鴿的放飛、集訓(xùn)等導(dǎo)致其活動(dòng)范圍十分廣泛，而且據(jù)報(bào)道，目前有250余種鳥類可自然或人工感染新城疫病毒(NDV)[3]，因此，賽鴿作為自然宿主也可使其他易感動(dòng)物交叉感染發(fā)生新城疫。KOMMERS 等[4]發(fā)現(xiàn)，鴿新城疫病毒在白羽來航雞體內(nèi)傳代后毒力增強(qiáng)，引起2周齡雞感染后出現(xiàn)明顯臨床病癥并導(dǎo)致死亡。張淑霞等[5]發(fā)現(xiàn)，用LaSota油佐劑滅活疫苗免疫的肉種鴿對(duì)鴿新城疫病毒SX株人工感染的保護(hù)率僅為66.7%。由此可見，鴿在新城疫的傳播過程中扮演著不可忽視的病毒攜帶者的角色，故對(duì)鴿新城疫的防控要足夠重視。

新城疫病毒基因組按3′到5′端的順序?yàn)镹P-P-M-F-HN-L 6個(gè)基因片段，其中F蛋白是重要的致病性因子，與新城疫病毒的毒力強(qiáng)弱密切相關(guān)，是新城疫病毒分子病毒學(xué)重點(diǎn)研究對(duì)象[6-7]。本試驗(yàn)從河北送檢賽鴿疑似新城疫病料中分離到1株病毒，經(jīng)鑒定該分離毒株為新城疫病毒，命名為HB株；隨后進(jìn)行致病性試驗(yàn)和毒力測(cè)定。同時(shí)對(duì)其F基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，將其與GenBank中已發(fā)表的流行毒株和我國(guó)部分疫苗毒株的F基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析和氨基酸同源性比較，旨在確定鴿群中新城疫流行病毒的分子遺傳特征及變異情況，為鴿群新城疫疫苗毒株的選擇提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料及供試動(dòng)物 疑似賽鴿新城疫的病料，由河北某賽鴿養(yǎng)殖場(chǎng)提供；SPF級(jí)種蛋購于山東省濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司；1日齡雛雞由本實(shí)驗(yàn)室孵化；6周齡SPF雞購于北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；30～40日齡、未經(jīng)任何免疫試驗(yàn)雛鴿購于張家口市某肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 新城疫標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原和陽性血清、禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(H5、H7和H9)和雞減蛋綜合征陽性血清購于北京中越科技有限公司；RNAiso Plus、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0購于TaKaRa(大連)有限公司；DEPC、50×TAE購于北京索萊寶科技有限公司；TIANgel Midi Purification Kit購于天根生化科技有限公司；乙醇、氯仿、異丙醇等購于天津光復(fù)精細(xì)化學(xué)研究所有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離鑒定 取病鴿肝臟、脾臟、肺臟、胰腺等器官，常規(guī)處理后接種SPF雞胚，0.2 mL/胚，96 h后收獲尿囊液。連續(xù)盲傳3代后，收獲病毒作為待檢病毒。將上述待檢病毒用血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗(yàn)進(jìn)行初步判定。

1.2.2 分離病毒致病性試驗(yàn) 取分離病毒進(jìn)行鴿子人工感染試驗(yàn)，將12只未經(jīng)免疫的30～40日齡雛鴿隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組，每組6只，感染組肌肉注射0.2 mL病毒液，對(duì)照組注射0.2 mL生理鹽水，觀察臨床癥狀，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和死亡率。將發(fā)病死亡的鴿子及時(shí)進(jìn)行病理剖檢，取肝臟、脾臟、肺臟、胰腺、小腸等臟器組織，用10%福爾馬林固定，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，做病理切片。

1.2.3 分離病毒毒力指標(biāo)測(cè)定 分離病毒毒力測(cè)定指標(biāo)主要有雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)、1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)和6周齡雛雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)，具體檢測(cè)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)際獸疫局(OIE)推薦的動(dòng)物疫病診斷方法和生物制劑要求手冊(cè)[8]。

1.2.4 分離病毒分子特征分析

1.2.4.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank中已發(fā)表的新城疫病毒F基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性上下游引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增F片段大小為1 897 bp，引物由上海生工生物工程公司合成。引物信息見表1。

表1 F基因的PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 PCR amplification primer sequences of F gene

1.2.4.2 RT-PCR 按照RNAiso Plus說明書提取病毒RNA，加入適量DEPC水溶解RNA沉淀，按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0說明書步驟

進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系：MgCl24 μL、10×RT Buffer 3 μL、dNTP Mixture 2 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、AMV Reverse Transcriptase XL 1 μL、Oligo dT-Adaptor Primer 1 μL、RNA 10 μL，加水至 30 μL。樣品加好混勻后，42 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物為F基因的模板鏈，隨后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：5×PCR Buffer 10 μL、滅菌水27.75 μL、TaKaRa ExTaqHS 0.25 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、模板鏈10 μL，總體積50 μL。按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，而后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

按照TIANgel Midi Purification Kit說明書進(jìn)行DNA回收，然后取2 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA含量。由上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.4.3F基因序列分析 將測(cè)得的F基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，從GenBank獲取已發(fā)表的F基因序列(表2)，按照文獻(xiàn)[9]的方法取F基因47—420位的374個(gè)核苷酸對(duì)表2中所列基因進(jìn)行分型，利用DNAStar和MEGA 6.06軟件將分離到的HB株與表2中的各個(gè)基因型毒株以及傳統(tǒng)疫苗毒株LaSota、V4、B1株比較，進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹的繪制和氨基酸序列同源性的分析。

表2 試驗(yàn)用新城疫毒株的相關(guān)信息Tab.2 Properties of Newcastle disease virus strains in the study

注：“—”表示GenBank中無此項(xiàng)信息記錄。

Notes: “—” means that there is no record of this information in GenBank.

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離鑒定

SPF雞胚在72 h內(nèi)全部死亡，并且死亡雞胚可見全身出血，雞胚尿囊液HA效價(jià)為7 log2，經(jīng)傳代后其效價(jià)達(dá)9 log2。HI試驗(yàn)結(jié)果顯示，新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清可抑制待檢病毒凝集紅細(xì)胞，而禽流感及雞綜合征標(biāo)準(zhǔn)陽性血清未能抑制待檢病毒凝集紅細(xì)胞，證明分離到的毒株為新城疫病毒，將其命名為HB株。

2.2 分離病毒致病性試驗(yàn)

鴿子在感染后48 h表現(xiàn)出精神沉郁、采食減少，伴有黃綠色下痢，并有腫眼流淚、扭頭歪頸、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀；感染后4 d，有1只鴿子死亡；感染后第6天，其余5只鴿子也全部死亡，死亡率為100%。

剖檢死亡鴿子可見，頸部皮下組織出血；十二指腸出血、腸壁變薄，直腸和泄殖腔黏膜有大量的出血點(diǎn)；胰腺腫脹、出血；心冠脂肪組織有點(diǎn)狀出血；肺出血、腫大；腺胃乳頭有出血點(diǎn)，肌胃有條狀出血；脾臟腫大，有點(diǎn)狀出血；氣管環(huán)有出血(圖1)。

A.胰腺出血;B.頸部皮下出血;C.肌胃出血;D.心冠脂肪組織出血;E.脾臟出血、腫大;F.氣管環(huán)出血

從圖2可看出，感染鴿子肺臟靜脈充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)于部分血管外圍，肺房壁上皮細(xì)胞變性，部分壞死脫落，囊腔內(nèi)有紅細(xì)胞及淋巴細(xì)胞；腦組織微血管出現(xiàn)明顯充血和淤血變化，其小血管出現(xiàn)炎性細(xì)胞滲出；脾臟小梁結(jié)構(gòu)不清晰，紅白髓界限模糊，組織間有大量紅細(xì)胞；心肌纖維腫脹、纖維間有大量的紅細(xì)胞；胰腺組織各級(jí)血管擴(kuò)張充血，部分血管外圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)中散在少量紅細(xì)胞及淋巴細(xì)胞；肝臟血管擴(kuò)張充血，多數(shù)肝竇擴(kuò)張充血，間質(zhì)增寬，其內(nèi)散在紅細(xì)胞和蛋白質(zhì)滲出物；腎臟組織間有紅細(xì)胞，血管周圍有大量炎性細(xì)胞；小腸黏膜下出血明顯，小腸絨毛出血、壞死，大量小腸絨毛斷裂、脫落。

2.3 分離病毒毒力測(cè)定

HB株MDT為52.8 h，ICPI為1.78，IVPI為2.59，根據(jù)國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)推薦的判定標(biāo)準(zhǔn)，HB株屬于強(qiáng)毒株。

2.4 分離病毒分子特征

2.4.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物，目的片段在1 897 bp左右，如圖3所示，擴(kuò)增出的片段與目的片段大小一致，含有1個(gè)大小為1 662 bp的完整開放閱讀框，編碼553個(gè)氨基酸。

2.4.2F基因遺傳進(jìn)化分析 將此次分離到的鴿新城疫強(qiáng)毒株HB株與GenBank中已發(fā)表的22株不同種屬的新城疫病毒F基因進(jìn)行比較，根據(jù)F基因高變區(qū)(47—420位)核苷酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹，如圖4所示。結(jié)合進(jìn)化樹與BLAST比對(duì)結(jié)果可知，分離到的HB株屬于Ⅵ型，HB株F基因與pigeon/Qinghai/1344/2017的序列相似性高達(dá)98.45%，與基因型為Ⅵ型的pi/CH/LGD/110208、dove/Italy/2736/00、Q-GB 506/97、ASTR/74、CH-1/95、Ostrich/SX-01/06在同一進(jìn)化分支上；同時(shí)可看到HB毒株與國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)新城疫疫苗毒株LaSota、B1、V4、Mukteswar株遺傳距離較遠(yuǎn)，表明分離到的HB株與目前國(guó)內(nèi)疫苗毒株基因型差異明顯。

▲表示分離的HB株;●表示常用疫苗株LaSota、V4、B1、Mukteswar

2.4.3 氨基酸序列分析 將測(cè)得的HB株F基因核苷酸序列通過DNAStar軟件翻譯為氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HB株F蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，符合新城疫強(qiáng)毒株特點(diǎn)。通過DNAStar軟件中的MegAlign程序?qū)B株F蛋白與GenBank已發(fā)表的表2中的22株新城疫病毒F蛋白進(jìn)行氨基酸序列相似性比較，結(jié)果如圖5所示，氨基酸相似性在83.8%～99.5%，其中HB株與pigeon/Qinghai/1344/2017相似性最高，達(dá)99.5%；與TW/84C氨基酸序列相似性最低，為83.8%；與傳統(tǒng)疫苗毒株V4、B1、LaSota、Mukteswar株的相似性在88.1%～90.2%，表明分離的HB株與國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)疫苗毒株有一定差異。

圖5 HB株F蛋白氨基酸序列同源性分析Fig.5 Amino acid sequence homology analysis of HB strain F protein

3 結(jié)論與討論

由于賽鴿在放飛過程中與各地野鳥、水禽、野鴿等接觸機(jī)會(huì)多，導(dǎo)致賽鴿感染新城疫病毒的概率大大增加，而且鴿亦可作為病毒攜帶者傳播給其他禽類，譬如雞、野鳥等，給現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴(yán)重的危害。因此，人們對(duì)鴿新城疫的防控意識(shí)需要大大加強(qiáng)。

本試驗(yàn)從河北地區(qū)賽鴿疑似新城疫病例中分離到1株病毒，經(jīng)HA和HI試驗(yàn)證實(shí)分離毒株為新城疫病毒(命名為HB株)。為了確定HB株的致病力，將分離病毒肌肉接種新城疫抗體陰性雛鴿，感染鴿子出現(xiàn)精神沉郁、食欲廢絕、黃綠色下痢以及神經(jīng)癥狀，在感染后6 d內(nèi)全部死亡，死亡率為100%，這與發(fā)病鴿的臨床表現(xiàn)一致，其剖檢變化也與臨床發(fā)病鴿子病理變化相吻合，即肺臟、腸道、胰腺、腺胃等明顯腫脹、出血。

為了確定HB株的毒力特征，根據(jù)OIE標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定其MDT、ICPI和IVPI。強(qiáng)毒型判定標(biāo)準(zhǔn)為MDT 40～60 h、ICPI >1.6和IVPI>2.0[8]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，HB株MDT為52.8 h、ICPI為1.78和IVPI為2.59，屬于強(qiáng)毒株。袁小遠(yuǎn)等[10]從北京鴿群中分離到新城疫病毒PB9601株，測(cè)定毒力特征時(shí)發(fā)現(xiàn)該毒株的MDT、ICPI和IVPI分別為50.5 h、1.65和2.36，與本試驗(yàn)中HB株毒力指標(biāo)相似，均符合新城疫強(qiáng)毒株的生物學(xué)毒力指標(biāo)。

王林等[11]從北京免疫鴿群分離到BJP13株，發(fā)現(xiàn)該毒株接種雞胚后72 h內(nèi)全部死亡，其F蛋白裂解位點(diǎn)112—117位氨基酸序列為RRQKRF，符合強(qiáng)毒株的分子特征。目前認(rèn)為，鴿新城疫是雞新城疫病毒跨種感染鴿群適應(yīng)的結(jié)果，具有很強(qiáng)的宿主特異性。研究表明，雖然大多數(shù)鴿源新城疫毒株F蛋白具有強(qiáng)毒株氨基酸的特征，但是其在雞群中復(fù)制能力較差，甚至對(duì)雞群沒有致病力[12]。因此，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)是否可作為評(píng)價(jià)鴿新城疫病毒致病性的指標(biāo)還有待進(jìn)一步研究。

目前，絕大多數(shù)鴿新城疫病毒基因型屬于基因Ⅵ型[13-14]。本研究中HB株經(jīng)RT-PCR后進(jìn)行F基因測(cè)序及進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，該毒株F基因片段為1 897 bp，含有1個(gè)大小為1 662 bp的完整開放閱讀框，編碼553個(gè)氨基酸。其核苷酸序列通過DNAStar翻譯為氨基酸序列，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸排列為112R-R-Q-K-R-F117，結(jié)合致病性試驗(yàn)和毒力測(cè)定證實(shí)，本研究中分離的鴿新城疫病毒HB株為強(qiáng)毒株。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，HB株為Ⅵ型，其與pigeon/Qinghai/1344/2017的序列相似性高達(dá)98.45%。此外，與其在同一分支、親緣關(guān)系較近的毒株還有Ⅵ型的pi/CH/LGD/110208、dove/Italy/2736/00、GB 1168/84、Q-GB 506/97、ASTR/74、CH-1/95、Ostrich/SX-01/06等，這與目前報(bào)道流行的鴿新城疫病毒屬于Ⅵ型一致[15]。但是HB株與傳統(tǒng)新城疫疫苗毒株LaSota、B1、V4、Mukteswar株遺傳距離較遠(yuǎn)。以上結(jié)果表明，目前在鴿群流行的新城疫病毒株與常規(guī)雞源性新城疫疫苗毒株基因型存在一定差異，這也是導(dǎo)致鴿群中新城疫流行的主要因素。朱杰等[16]在湖南及江蘇免疫鴿群中分離出2株新城疫病毒，將其與疫苗毒株LaSota進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示，這2株新城疫病毒與LaSota株抗原性差異很大，這可能是鴿群使用LaSota疫苗免疫后發(fā)生新城疫病毒感染的重要原因之一[17]。因此，為了有效防控鴿新城疫的發(fā)生，研制用于預(yù)防鴿群中新城疫病毒感染的基因Ⅵ型新型疫苗成為必然選擇。