李佳璇 王濤 李樹(shù)強(qiáng) 司徒金容 劉吉升

摘 ?要：為探究LPS（脂多糖）等外源物質(zhì)對(duì)家蠶MyD88基因表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)將無(wú)菌水、LPS和大腸桿菌注射到5齡家蠶幼蟲(chóng)體腔內(nèi)，在0、3、6和24 h進(jìn)行解剖取樣，通過(guò)凝膠電冰分析不同時(shí)間MyD88基因在各組織中的表達(dá)水平。電泳條帶顯示，在脂肪體組織中，注射LPS和大腸桿菌均可引起MyD88基因上調(diào)表達(dá)，6 h效果最佳;在中腸組織中，注射LPS 3 h 時(shí)MyD88基因表達(dá)量最高，注射大腸桿菌在6 h時(shí)條帶亮度最亮。結(jié)果表明MyD88基因可能響應(yīng)LPS和大腸桿菌引起的家蠶免疫表達(dá)反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：家蠶;MyD88;注射;LPS;大腸桿菌

MyD88是機(jī)體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到關(guān)鍵作用[1]。Lord等發(fā)現(xiàn)髓樣分化基因家族的新成員MyD88，認(rèn)為MyD88能夠調(diào)節(jié)髓樣細(xì)胞分化[2]。在哺乳類動(dòng)物中，MyD88基因主要表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞中[3]。

在家蠶中，MyD88基因在中腸（midgut，MG）、脂肪體（fat body，F(xiàn)B）、表皮（epidermis，EP）等主要免疫器官中的表達(dá)量相對(duì)其他較高[4]。MyD88是家蠶先天免疫通路Toll通路上重要的接頭分子，研究表明，MyD88與活化的Toll受體的TLR結(jié)構(gòu)域連接，再與Tube、Pelle蛋白結(jié)合成三聚體形式，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)[5]。

革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分為L(zhǎng)PS（lipopolysaccharide），機(jī)體感染后會(huì)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，LPS作為大腸桿菌（Escherichia coli）細(xì)胞壁的主要成分，參與大腸桿菌引起的免疫反應(yīng)[6]。Liu等研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠激起昆蟲(chóng)先天免疫反應(yīng)，同時(shí)BmToll9-2基因在家蠶幼蟲(chóng)的不同組織參與LPS等外源病原體的識(shí)別過(guò)程[7]。然而，作為Toll通路的下游因子MyD88能否對(duì)LPS做出免疫反應(yīng)，目前在家蠶中還未明確。

本文利用注射法，對(duì)家蠶5齡幼蟲(chóng)進(jìn)行不同處理，通過(guò)凝膠電泳條帶，分析MyD88基因在不同處理下的表達(dá)水平。本研究進(jìn)一步揭示家蠶Toll通路中MyD88基因?qū)用嫔厦庖呦到y(tǒng)對(duì)特定外源物質(zhì)的響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

本研究使用廣東省農(nóng)科院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供的P50品系家蠶。孵化后的幼蟲(chóng)在25℃、60 %的相對(duì)濕度、光周期12L：12D條件下，以新鮮桑葉飼養(yǎng)。

1.2 家蠶幼蟲(chóng)的注射實(shí)驗(yàn)及解剖取樣

對(duì)家蠶幼蟲(chóng)分別注射10 μLLPS溶液（2.5 mg/μL）和10 μL大腸桿菌稀釋液（2.5 × 106 cells/μL），同時(shí)以注射等量無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。在注射后的0、3、6 和24 h進(jìn)行解剖取樣，平行取樣3組，所有樣品迅速置于無(wú)RNA酶的離心管中，保存于-80℃冰箱備用。

1.3 RNA的提取和cDNA的合成

采用RNAiso Plus（TaKaRa）試劑盒，按其說(shuō)明書提取總RNA，并用NanoDrop 2000檢測(cè)，置于-80℃保存。參照PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）說(shuō)明書，采用10 μL的反應(yīng)體系;25℃ 10 min，42℃ 60 min的反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 PCR擴(kuò)增和凝膠電泳

使用Primer Premier 6.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)PCR引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。內(nèi)參基因選擇BmActin基因，檢測(cè)基因?yàn)镸yD88基因。采用2 × Taq PCR MasterMix（艾德萊）試劑盒和20 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃ 2 min;94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，共33次循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理后脂肪體組織中BmMyD88基因表達(dá)水平分析

通過(guò)凝膠電泳圖分析，注射無(wú)菌水時(shí)，MyD88基因在0、3 h條帶較暗，6、24 h的條帶亮度相近（圖1：A）;注射LPS時(shí)，MyD88基因在3 h的條帶亮度明顯增強(qiáng)，6 h達(dá)到最亮，24 h減弱到最暗（圖1：B）;注射大腸桿菌，MyD88基因在3 h的條帶亮度略微增強(qiáng)，6 h條帶最亮（圖1：C）。

2.2 不同處理后中腸組織中BmMyD88基因表達(dá)水平分析

通過(guò)凝膠電泳圖分析，注射無(wú)菌水時(shí)，MyD88基因在0、3、6 和24 h的條帶亮度相對(duì)一致（圖2：A）;注射LPS時(shí)，MyD88基因在3 h的條帶亮度明顯增強(qiáng)，6、24 h逐漸變暗（圖2：B）;注射大腸桿菌，MyD88基因在6 h的條帶最亮，24 h的條帶亮度減弱到與3 h相近（圖2：C）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)家蠶5齡幼蟲(chóng)進(jìn)行LPS注射，結(jié)果顯示，注射LPS后MyD88基因均能在脂肪體和中腸中于不同時(shí)間段被誘導(dǎo)表達(dá)，中腸中效果更加明顯。中腸作為細(xì)菌經(jīng)口侵入家蠶體內(nèi)的第一道防線，感染后能抗菌基因的表達(dá)，引起腸道免疫反應(yīng)[8]，同時(shí)家蠶幼蟲(chóng)在5齡階段接近變態(tài)發(fā)育，此時(shí)中腸的蛋白種類與數(shù)量提高，中腸活動(dòng)十分旺盛[9]。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用大腸桿菌注射檢驗(yàn)，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，分析發(fā)現(xiàn)大腸桿菌較LPS誘導(dǎo)效果更佳、時(shí)長(zhǎng)更久。推測(cè)由于大腸桿菌含有更多的LPS，另一方面同時(shí)大腸桿菌中含有與家蠶Toll通路中相互作用的活性物質(zhì)，從而促進(jìn)對(duì)家蠶MyD88基因的誘導(dǎo)表達(dá)[10]。

哺乳動(dòng)物中TLR4被LPS激活后會(huì)引起早期的MyD88依賴型信號(hào)通路[11]，昆蟲(chóng)的Toll9具有和哺乳動(dòng)物TLR4在進(jìn)化上相對(duì)保守，結(jié)構(gòu)相似[12-13]。張若男等研究發(fā)現(xiàn)，BmToll9蛋白在家蠶響應(yīng)LPS的免疫途徑與哺乳動(dòng)物中響應(yīng)LPS的蛋白受體TLR4極其類似[14]，推測(cè)家蠶Toll通路中MyD88基因也能被LPS激活，參與LPS和大腸桿菌引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

綜上所述，注射LPS和大腸桿菌激起家蠶幼蟲(chóng)MyD88基因上調(diào)表達(dá)，揭示含LPS的革蘭氏陰性菌能夠激起家蠶的免疫反應(yīng)，MyD88基因可能參與昆蟲(chóng)Toll通路對(duì)LPS等外源病原體的識(shí)別過(guò)程。為明確MyD88基因在家蠶先天免疫Toll通路系統(tǒng)中的作用，還需通過(guò)基因敲除等手段進(jìn)一步研究。

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項(xiàng)目名稱：“攀登計(jì)劃”廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(xiàng)資助。