王巍　張連齊　楊海燕　夏燕云　李建豪

【摘 要】目的：探討微小RNA-21在口腔鱗癌組織中的表達(dá)水平，及其對(duì)鱗癌細(xì)胞系中的生物學(xué)功能的影響。方法：實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)10例口腔鱗癌標(biāo)本中微小RNA21的表達(dá)情況?？谇击[癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染微小RNA抑制劑后，檢測(cè)其對(duì)鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡的影響。結(jié)果：微小RNA21在口腔鱗癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，與對(duì)照組比較有顯著差異。微小RNA21抑制劑轉(zhuǎn)染鱗癌細(xì)胞系后，細(xì)胞的周期發(fā)生了變化，細(xì)胞凋亡比率增高，侵襲能力下降。結(jié)論：微小RNA21在口腔鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，微小RNA21可以抑制口腔鱗癌細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，起到了類似原癌基因的作用。

【關(guān)鍵詞】口腔鱗癌；微小RNA；增殖；凋亡

【中圖分類號(hào)】R36 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2019）01-0011-01

頜面部的惡性腫瘤以口腔鱗狀細(xì)胞癌最多見，所占比例在80%以上，其具有侵襲局部周圍組織及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，晚期還可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。目前，在手術(shù)中還無法做到腫瘤外科與整形外科完全兼顧，治療后患者多存在明顯的功能障礙和容貌破壞，嚴(yán)重威脅人們的身心健康。微小RNA參與很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，其中微小RNA21在多種實(shí)體瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，并且起到粗癌基因的角色[2]。在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中最重要的機(jī)制是細(xì)胞中原癌基因激活和抑癌基因失活，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖和（或）凋亡調(diào)節(jié)失控[3]。因此，本課題研究微小RNA21在口腔鱗癌細(xì)胞系中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 本研究中參與的病人均于術(shù)前簽署手術(shù)知情同意書。病理標(biāo)本收集自2017年1月至2017年12月間，就診于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院。10對(duì)口腔鱗癌組織及相應(yīng)的癌旁正常粘膜組織均采集自口腔鱗癌患者初次手術(shù)切除的外科標(biāo)本。全部病人在手術(shù)前均未經(jīng)任何放療和化療。收集到的標(biāo)本立刻放入凍存管中，標(biāo)記清楚儲(chǔ)存于-80℃?；颊叩腡NM分期按照2002年美國癌癥聯(lián)盟-國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 研究方法 提取組織中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄后實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中微RNA21的表達(dá)情況。培養(yǎng)鱗癌細(xì)胞株，收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞支撐細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)分為3組，即空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。利用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)細(xì)胞的增值情況，流式細(xì)胞分析的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1 微小RNA21在鱗癌組織中的表達(dá) 10例樣本經(jīng)RNA提取后，稀釋10倍，利用Nano測(cè)定RNA濃度，滿足純度的樣本進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10例口腔鱗癌患者組織中微小RNA21呈現(xiàn)高表達(dá)。癌周對(duì)照組織相對(duì)表達(dá)值為1，那么癌組織中平均表達(dá)水平為1.9259±0.3615，癌組織的表達(dá)顯著高于配對(duì)的癌旁組織（t=2.15，P<0.05）。

2.2 細(xì)胞增殖的變化 利用細(xì)胞活性（R）計(jì)算公式將對(duì)照細(xì)胞統(tǒng)一記作1.0，便于比較不同濃度實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)。三組細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞增殖情況，數(shù)據(jù)見表1.微小RNA21抑制劑組細(xì)胞活性受到了抑制，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析后，有顯著意義。

2.3 細(xì)胞周期的變化 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)候，收集細(xì)胞，按照細(xì)胞周期試劑盒操作，使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)，使用細(xì)胞周期分析軟件分析結(jié)果顯示見表2。轉(zhuǎn)染組處于G1期的細(xì)胞所占比例明顯高于非特異轉(zhuǎn)染組和空白組，三者之間進(jìn)行比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；特異性轉(zhuǎn)染組處于S期的細(xì)胞所占比例也明顯低于非特異轉(zhuǎn)染組和空白組，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 細(xì)胞凋亡變化檢測(cè)結(jié)果 使用BD公司細(xì)胞凋亡軟件，用Annexinv-FITC和PI標(biāo)記后24小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果分析顯示：空白對(duì)照組和非特異轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率分別為8.94%和7.91%，而轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率是24.24%?？瞻捉M合非特異轉(zhuǎn)染組的凋亡比例相似，均小于特異轉(zhuǎn)染組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

迄今為止，外科手術(shù)仍然是口腔頜面部良惡性腫瘤的主要治療手段，由于頜面部血管和神經(jīng)豐富，且解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，為手術(shù)治療制造了很大障礙[4]。而基因治療自上世紀(jì)八十年代開始受到廣泛關(guān)注，目前采用RNA干擾技術(shù)針對(duì)癌基因和抗癌基因進(jìn)行相關(guān)干擾，阻止或促進(jìn)其表達(dá)，從而影響特定細(xì)胞比如瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性，改變其細(xì)胞活性，進(jìn)而達(dá)到抑制細(xì)胞生長，延緩腫瘤發(fā)展的目的[5]。

本課題選擇了10例口腔鱗癌患者的組織標(biāo)本和鱗癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象，以研究微小RNA21在鱗癌組織中的表達(dá)情況。同時(shí)，為了去除標(biāo)本基因表達(dá)的個(gè)體差異，在腫瘤資質(zhì)周圍采集了正常組織粘膜標(biāo)本作為對(duì)照。研究結(jié)果表明：在口腔鱗癌組織細(xì)胞中微小RNA21的表達(dá)明顯升高，而在正常的腫瘤周圍組織中微小RNA的表達(dá)明顯低于實(shí)驗(yàn)組。這同其他的一些在其他實(shí)體腫瘤進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，這說明微小RNA21和腫瘤的生物學(xué)性狀的改變關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染微小RNA21抑制劑實(shí)驗(yàn)組，當(dāng)微小RNA21表達(dá)受抑制后，鱗癌細(xì)胞表達(dá)微小RNA21的含量明顯減少，與對(duì)照組相比有顯著差異，證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。將微小RNA21抑制劑轉(zhuǎn)染入實(shí)驗(yàn)鱗癌細(xì)胞系后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞增殖、周期和凋亡的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微小RNA21受抑制后，細(xì)胞的增殖活性受到抑制，凋亡細(xì)胞明顯增多。

以上結(jié)果均提示微小RNA21在口腔鱗癌細(xì)胞中起著癌基因的作用，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。

參考文獻(xiàn)

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基金項(xiàng)目：

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（課題編號(hào)：12511225）